脓毒症患者外周血淋巴细胞亚群的表达和绝对值与PCT相关性分析

2021-03-24陈建安钟坚周静王坤

中国医学创新 2021年16期

陈建安钟坚周静王坤

【摘要】目的：探讨脓毒症患者的外周血淋巴细胞亚群表达和绝对值情况，了解脓毒症患者的免疫功能状况，同时观察血清PCT与淋巴细胞亚群表达的相关性，进一步探究机体免疫功能状态与机体炎症状态的关系。方法：选取2017年1月-2019年10月在本院被确诊为脓毒症的56例住院患者为研究对象进行回顾性分析，并将其纳入脓毒症组。选取健康者22例为健康对照组。检测外周血淋巴细胞亚群抗原表达情况、绝对值情况以及血清PCT水平，比较两组上述检测指标。结果：脓毒症组的淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD8+的表达率均低于健康对照组，CD3-CD19+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+16+的表达率均高于健康对照组，差异均有統计学意义（P<0.05）。脓毒症组外周血CD3+绝对值、CD3+CD4+绝对值、CD3+CD8+绝对值均低于健康对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。脓毒症患者的CD3+的表达率与血清PCT水平呈负相关，CD3-CD19+的表达率与血清PCT水平呈正相关（P<0.05）。结论：脓毒症患者存在免疫功能紊乱，T细胞免疫功能与炎症情况有关;CD3+CD56+16+ NKT的表达率增多，在脓毒症患者免疫功能起到重要的免疫调节作用。

【关键词】脓毒症淋巴细胞亚群降钙素原流式细胞术

Correlation Analysis of the Expression and Absolute Value of Lymphocyte Subsets in Peripheral Blood of Sepsis Patients with PCT/CHEN Jian’an， ZHONG Jian， ZHOU Jing， WANG Kun. //Medical Innovation of China， 2021， 18（16）： -143

[Abstract] Objective： To investigate the expression and absolute value of lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with sepsis， to understand the immune function status of patients with sepsis. Meanwhile， to observe the correlation between serum PCT and lymphocyte subsets expression， to further explore the relationship between the immune function status of the body and the inflammatory status of the body. Method： A retrospective analysis was conducted on 56 inpatients diagnosed with sepsis in our hospital from January 2017 to October 2019， and they were included in the sepsis group， 22 healthy subjects were selected as the healthy control group. The antigen expression， absolute value and serum PCT level of peripheral blood lymphocyte subsets were detected， and the above detection indexes were compared between the two groups. Result： The expression rates of lymphocyte subsets CD3+ and CD3+CD8+ in sepsis group were lower than those in healthy control group， and the expression rates of CD3-CD19+， CD4+/CD8+， and CD3+CD56+16+ were higher than those in healthy control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The absolute value of CD3+， CD3+CD4+ and CD3+CD8+ in peripheral blood of sepsis group were lower than those of healthy control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression rate of CD3+ in sepsis patients was negatively correlated with serum PCT level， while the expression rate of CD3-CD19+ was positively correlated with serum PCT level （P<0.05）. Conclusion： Sepsis patients have immune dysfunction， T cell immune function is related to inflammation; The expression rate of CD3+CD56+16+ NKT is increased， which plays an important role in immune regulation in patients with sepsis.

[Key words] Sepsis Lymphocyte subsets Procalcitonin Flow cytometry

First-author’s address： Donghua Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University， Dongguan 523110， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.16.034

脓毒症是由潜在或已知感染因素引起机体全身炎症反应导致的器官功能障碍综合征，严重脓毒症和脓毒性休克患者的病死率高，近年来其生存率尚未有明显的改善，机体细胞介导免疫在脓毒症及其多脏器功能损伤的病理过程起重要作用[1]。急性脓毒症一般被认为是“细胞因子风暴”的结果，这与免疫细胞的活化和促炎因子的释放高度相关，并且在初始阶段之后，似乎还伴随着以依赖性方式快速诱导免疫细胞衰竭的过程[2]，从而导致机体固有细胞免疫功能和体液免疫功能在全身炎症反应时可被广泛地激活和功能障碍[3]。因此，本研究通过检测分析脓毒症患者淋巴细胞亚群水平来探讨患者机体的免疫功能状态对脓毒症诊断、治疗、预后的意义。与此同时，由于降钙素原（PCT）是目前临床常用的反应机体感染状态的指标之一[4]，将其与淋巴细胞亚群的变化进行分析，从而探究机体的免疫状态是否与感染程度相关。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年1月-2019年10月在本院被确诊为脓毒症的56例住院患者为研究对象进行回顾性分析，并将其纳入脓毒症组。（1）纳入标准：入住急诊医学科和重症医学科并符合2016年《SSC指南》中脓毒症诊断标准者;年龄>18岁。（2）排除标准：具有肿瘤、自身免疫性疾病及原发器官功能障碍者;入院前2周使用糖皮质激素或其他能影响免疫功能药物者;妊娠、哺乳及月经期女性。选取健康者22例为健康对照组。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂仪器为美国贝克曼-库尔特（Beckman Coulter）公司的FC500 MCL流式细胞仪，日本SYSMEX XN-3000血细胞分析仪，试剂为SYSMEX公司提供的相应配套试剂;FC500 MCL流式细胞仪试剂为Beckman Coulter公司提供，测定T淋巴细胞亚群使用的单克隆抗体包括（批号7536275）：CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5;测定B淋巴细胞及NK细胞亚群使用的单克隆抗体包括（批号7580213）：CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5;其他试剂：磷酸盐缓冲溶液（PBS）、红细胞裂解液等。

1.2.2 标本收集方法分别抽取脓毒症患者、和健康对照者外周静脉血2 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中并混匀，TBNK淋巴细胞亚群分析待检测;同时抽取脓毒症患者外周静脉血2 mL，置于促凝干燥管内，3 500 r/min，离心5 min，分离血清，待进行PCT检测。

1.2.3 检测方法分别加入T淋巴细胞亚群、BNK淋巴细胞亚群的单克隆抗体试剂各5 μL至流式专用管内底端，分别加入50 μL EDTA抗凝全血，震荡混匀，室温避光反应20 min，加入红细胞裂解液300 μL，室温避光20 min，加入300 μL PBS混匀，上机检测;通过分析软件得到CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD56+16+、CD3+CD56+16+表达率，同时乘以淋巴细胞的绝对值计数，从而得到相应淋巴细胞亚群的绝对值。

1.2.4 PCT的检测方法仪器为法国生物梅里埃（bioMerieux， sa）公司的全自动荧光免疫分析仪（VIDAS）;试剂盒为同一公司提供，即PCT测定试剂盒（酶联免疫荧光法）。严格按照仪器和试剂说明书进行操作。

1.3 统计学处理采用IBM SPSS Statistics 25.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，相关性分析用Pearson相关性检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较脓毒症组56例，男30例，女26例;年龄22～65岁，平均（48±12）岁。健康对照组22例，男12例，女10例;年龄28～72岁，平均（45±10）岁。两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 两组外周血淋巴细胞亚群表达情况比较脓毒症组的淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD8+的表达率均低于健康对照组，CD3-CD19+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+16+的表达率均高于健康对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;两组CD3+CD4+、CD3-CD56+16+的表达率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 两组外周血淋巴细胞亚群绝对值比较脓毒症组外周血CD3+绝对值、CD3+CD4+绝对值、CD3+CD8+绝对值均低于健康对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;两组CD3-CD19+绝对值、CD3-CD56+16+绝对值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.4 外周血淋巴细胞亚群表达率、绝对值与脓毒症患者的相关性分析脓毒症组血清PCT水平（41.07±35.53）ng/mL，高于健康对照组的（0.87±0.48）ng/mL，差异有统计学意义（t=5.319，P<0.05）。脓毒症组的CD3+、CD3-CD19+的表达率与血清PCT水平呈线性相关，脓毒症患者的CD3+表达率与血清PCT水平呈负相关，CD3-CD19+的表达率与血清PCT水平呈正相关（r=-0.271、0.217，P<0.05），但CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+16+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+16+表達率及CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD56+16+绝对值与血清PCT水平均无相关性，差异均无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

CD3是成熟T淋巴细胞的特征性标志，主要是与T细胞受体结合，将T细胞受体与抗原结合产生的活化信号传递到细胞内，又分为CD3+CD4+辅助性T（Th）细胞和CD3+CD8+的杀伤性T（Tc）细胞[5]，前者具有辅助体液免疫和细胞免疫的功能，后者有杀伤和抑制作用，可诱导和维持免疫抑制，一系列研究表明在脓毒症发展过程中，T淋巴细胞在介导细胞免疫应答时非常关键，可以明显减弱其增殖活力，Th2免疫反应更加突出，在Th2细胞介导早期往往有大量淋巴细胞凋亡，容易造成机体的炎症反应[6-7]。机体的免疫调节状态可以用CD4+/CD8+的比值进行预估，该值超出正常范围时，表示机体的免疫功能紊乱。当免疫系统处于负调节状态时，CD3+CD4+细胞反应性会下降或丧失，这导致其他免疫细胞，如B淋巴细胞、CD3+CD8+ T细胞、其他免疫细胞的增殖分化以及免疫调节能力均下降，进一步使得CD3+CD8+细胞相对性增加，因此当CD4+/CD8+比值下降程度较大时，说明机体可能处于免疫抑制状态[8]。CD3-CD19+细胞为B淋巴细胞，为体液免疫的主要功能细胞，CD3-CD56+16+细胞为NK细胞，是自然杀伤细胞，起到直接杀伤作用[9]，因此，上述细胞在表型、功能等各个方面的变化可能在很多疾病中均可作为疾病活动、复发和疗效的判定指标之一，具有很重要的临床意义[10]。

本研究结果显示，脓毒症组的CD3-CD19+表达率及CD4+/CD8+均高于健康对照组，CD3+、CD3+CD8+的表达率及外周血CD3+绝对值、CD3+CD4+绝对值、CD3+CD8+绝对值均低于健康对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），提示存在T淋巴细胞的缺失，细胞免疫功能明显受到抑制，机体的免疫功能紊乱，与Gouel-Chéron等[11]报道相似。动物实验以及临床研究也发现T淋巴细胞以及其亚群的数目在脓毒癥早期诊断及预后有意义[12]。与赵雪峰等[13]、李华福等[14]报道大致相同，亦有不同，本研究结果显示，与健康对照组相比，脓毒症组的CD3+CD4+的表达率无明显变化，CD4+/CD8+比值偏高，与预期和赵雪峰等[13]的结果相反，处于脓毒症休克患者同时存在着免疫抑制和自身免疫的过度激活，而导致这种状况，与龙盼等[15]报道相似;虽本研究CD3+CD4+的表达率无减少，但CD3+CD4+绝对值明显减少，提示淋巴细胞亚群绝对值计数能更好地反映患者细胞免疫功能状态。而当患者处于重度脓毒症或脓毒症休克时，特异性体液免疫增强，CD3-CD19+的表达率会上升，与孟祥忠等[16]报道相似。

PCT被认为是一项细菌感染的特异性指标，稳定性、灵敏度和特异性都较高[17]，作为脓毒症的诊断指标广泛应用[18]。在脓毒症患者中，可以认为血清PCT水平越高者，发生MODS的可能性越大，预后不良的可能性也越大，患者机体的炎症状态越严重[19]。研究表明，儿童血清PCT水平越高，患者机体感染程度越严重，其T淋巴细胞亚群选择性表达缺失越显著，这说明免疫抑制有利于感染炎症的进展[20]。本研究结果显示，脓毒症患者的CD3+表达率与血清PCT水平呈负相关，CD3-CD19+的表达率与血清PCT水平呈正相关，提示细胞免疫功能越低，脓毒症患者的炎症程度越严重。

CD3+CD56+16+细胞为NKT细胞，为一群独特的T淋巴细胞亚群，是被CD1d分子递呈的糖脂类抗原激活的免疫调节细胞[21]，在感染、自身免疫性疾病、内分泌、肿瘤中发挥作用[22]，NKT细胞被激活后分泌大量的细胞因子，如白细胞介素（IL-4、IL-10、IL-13）及干扰素等，通过影响Th1/Th2平衡，从而发挥免疫调节作用，是炎症反应与抗炎反应免疫平衡的基础[23-25]。本研究结果显示CD3+CD56+16+ NKT细胞表达率增多，提示其在脓毒症患者中起到重要的免疫调节作用，从而影响其细胞免疫功能的变化。

综上所述，脓毒症患者存在免疫功能紊乱，T细胞免疫功能与炎症情况有关;CD3+CD56+16+ NKT细胞在脓毒症患者中起到重要的免疫调节作用。

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