陈贵宇，李春臣，辜春霞，杨晨，江兰，罗涛，梅雪，张建武*

腹泻通常是由肠道疾病引起的症状，可由各种细菌（大肠埃希菌、志贺菌种、霍乱弧菌等）、病毒（诺如病毒、巨细胞病毒等）和寄生虫引起［1］。腹泻是严重影响人类健康和社会经济发展的多发病之一，尽管治疗腹泻的有效药物较多，但中药治疗腹泻具有疗效迅速、不良反应少、费用低廉等优势［2］。因此，世界卫生组织（WHO）仍鼓励寻找传统的抗腹泻中药［3］。

连翘是临床常用中药之一，为木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果实，味苦、无毒、性微寒，具有清热解毒、消肿散结的功效［4］，其药理作用主要有抗菌、保肝、非特异性免疫、保护心脏、抗氧化等。有研究表明，连翘属植物叶子与果实的成分和药理作用有较好的一致性［5］，而连翘叶中的黄酮类化合物具有良好的抑菌活性［6］，更好地印证了其药理作用。

本研究采用蓖麻油诱导的小鼠急性腹泻模型，观察连翘叶乙醇提取物（FS ext）对小鼠蓖麻油性腹泻的影响，同时探讨其对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响。

本研究创新点与不足：

（1）探究了连翘叶对肠平滑肌收缩的影响以及在腹泻方面的应用，此前对于连翘叶这方面药用价值的研究鲜少，丰富了其药用方向，同时也为这方面的研究提供了一定的理论依据。（2）对于连翘叶在腹泻方面的应用，没有明确模型针对的是临床上的何种腹泻。

1 材料与方法

1.1 研究时间 2018年6—12月。

1.2 药物提取 于四川省南充市采集连翘叶（CBY-2016-0003），经川北医学院药学院梅雪老师鉴定。将连翘叶放在恒温（60 ℃）电炉中干燥，粉碎成粗粉（粉碎机：FW177，泰斯特，天津），取50 g（使用电子分析天平：Mettle AE 240）放入1 L的圆底烧瓶中，用7倍于测量质量的乙醇作为溶剂，回流、萃取3次，滤液回收溶剂（旋转蒸发器：RE-52AA，雅荣，上海）浓缩，在真空减压干燥炉（ZK 6050B，Opson，武汉）中干燥得到FS ext，浸出率为24.55%。

1.3 植物化学分析

1.3.1 初步植物化学分析 对FS ext进行植物化学分析，以确定可能存在的苷类、多酚、黄酮类、多糖和有机酸［7］。水提液振荡后形成泡沫，说明FS ext中有皂苷；加入FeCl3试剂出现蓝绿色，说明FS ext中有酚类物质；加入AlCl3试剂出现黄色，说明FS ext中有黄酮类物质。

1.3.2 总黄酮含量测定 根据文献［8］测定FS ext的总黄酮含量。将0.5 ml FS ext与1.5 ml乙醇（75%v/v）、0.1 ml氯化铝（10% w/v）、0.1 ml乙酸钾（1 mol/L）和2.8 ml双蒸馏水混合，室温下培养30 min，然后用1750紫外-可见分光光度计（日本岛津）在435 nm处测量吸光度。用蒸馏水（0.1 ml）代替氯化铝作空白。芦丁有典型的黄酮类结构和紫外特征，且易分离，作为对照品比较易得，故本研究以芦丁作为标定曲线的标准对照，结果用芦丁当量mg/g提取物表示。

1.3.3 高效液相色谱法鉴别FS ext中的化学成分 采用高效液相色谱法对FS ext中的化学成分进行鉴别和检测，色谱柱为Aglient-ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水溶液为流动相，采用梯度洗脱（流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件见表1），结合波长切换技术于20 min将检测波长从330 nm切换为277 nm进行化学成分检测，流速为0.6 ml/min，柱温 28 ℃，进样量 5 μl。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

1.3.3.1 对照品溶液制备 取连翘苷和连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每 1 ml含0.265 mg连翘苷和0.373 mg连翘酯苷A的混合对照品溶液，混匀，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

1.3.3.2 供试品溶液制备 取FS ext 0.105 50 g，加甲醇定容至1 ml容量瓶中，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

1.4 实验药品及试剂 碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钙、氯化铁、氯化铝、醋酸钾〔成都市科隆化学品有限公司〕，氯乙酰胆碱〔成都华夏化学试剂有限公司（中国成都）〕，蓖麻油（河南省华龙药业有限公司），维拉帕米〔Medchemexpress有限公司（美国）〕，洛哌丁胺〔西格玛化学公司（美国圣路易斯）〕，色谱乙腈（成都市科隆化学品有限公司），纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司），盐酸〔成都市科隆化学品有限公司〕、氯化铁、甲醇（重庆腾华化工有限公司）、醋酸钾和氯化铝用于粗提物的植物化学分析。蒸馏水（四川优普超纯科技有限公司）用于制备标准溶液、稀释液和生理盐溶液（Tyrode溶液）。

1.5 仪器 家兔类通用实验器械，HW-400E恒温平滑肌槽（四川成都泰盟公司），BL-420F生物机能实验系统（四川成都泰盟公司），FT-100生物张力传感器（四川成都泰盟软件有限公司），优普纯水/超纯水制造系统（四川优普超纯科技有限公司），HH600-2B三用恒温水浴箱（金坛市科析仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（YDYQ，101-2A），粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司，FW177），电子分析天平（Mettle AE 240），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA），真空减压干燥箱（武汉奥普森试验设备有限公司，ZK 6050B）。

1.6 实验动物 选取110只健康昆明雌雄小鼠（18～22 g）以及42只健康家兔（2.0～2.5 kg），由川北医学院动物中心提供〔许可证编号：SYXK（chuan）2013-076〕，小鼠和家兔饲养于23～26 ℃、湿度适宜的实验室环境，12 h光照黑暗循环，期间可自由进食和饮水。本实验符合中国动物保护委员会的管理，并遵循动物伦理和实验准则。

1.7 实验方法

1.7.1 FS ext的急性毒性 取60只禁食4 h（可自由饮水）的小鼠随机分为0.5 g/kg FS ext试验组、1.0 g/kg FS ext试验组、2.0 g/kg FS ext试验组、4.0 g/kg FS ext试验组、8.0 g/kg FS ext试验组、16.0 g/kg FS ext试验组，每组10只，分别给予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0 g/kg、16.0 g/kg的FS ext进行灌胃，处理后的小鼠可自由饮水进食，记录14 d内小鼠的死亡情况和毒性迹象，建立相应的剂量-效应曲线，从而确定FS ext的半数致死剂量（LD50），以确定其安全性［9］。

1.7.2 对蓖麻油性腹泻的影响 另取50只小鼠随机分成阴性组、阳性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组，每组10只，阴性组给予0.9%氯化钠溶液（20 ml/kg）灌胃，阳性组给予洛哌丁胺（4 mg/kg）灌胃，0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组分别给予0.25、0.50、1.00 g/kg FS ext。给药30 min后，小鼠均给予蓖麻油0.4 ml灌胃，然后将每只小鼠放入单独的笼子中，地板衬有吸墨纸，将线网放置在离底部3 cm的笼中以使小鼠与吸墨纸隔开。观察4 h内以下指标：初始半固体粪便时间，固体、半固体、液体粪便数量。采用腹泻指数（EI）评估腹泻的严重程度［10］。EI=固体粪便数量×1+半固体粪便数量×2+液体粪便数量×3。

1.7.3 离体标本制备 选取健康家兔，实验前禁食24 h，自由饮水。用木槌击致头昏，解剖家兔，以胃幽门与十二指肠交界处为起始部，取空肠并立即放入通有95% O2和5% CO2混合气的台氏液中，将内容物冲洗干净并剪去肠系膜，剪成1.5～2.0 cm数段，一端用线结扎固定于通气沟，另一端固定于张力换能器。给予前负荷1 g，浴槽内温度维持在（37.0±0.5）℃，通气沟以每秒1～2个气泡的速度持续通入混合气，待基线稳定后开始实验［11］。

1.7.4 FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响 待空肠平滑肌张力稳定后，单剂量加入FS ext（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，这些浓度是累加所得，即后一个的浓度由前一个浓度累加，主要目的是为了观察家兔离体空肠平滑肌自发性收缩随FS ext的浓度变化而变化的趋势），以给药前的张力为100%，记录给药后空肠平滑肌自发性收缩的张力变化。按照上述方法，用维拉帕米（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L）处理家兔离体空肠平滑肌作为对照，记录给予维拉帕米后家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的张力变化。

1.7.5 FS ext对由乙酰胆碱（ACh）和KCl诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响 待空肠平滑肌张力稳定后，分别加入ACh（10 μmol/L）和KCl（60 mmol/L）预处理，出现最大波峰后，立即用台氏液冲洗肠管，等其稳定后，再次分别加入ACh（10 μmol/L）和KCl（60 μmol/L），15 min后，加入FS ext使其终浓度分别达0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，并记录空肠平滑肌自发性收缩稳定时的张力变化。按照上述方法，用维拉帕米（0.001、0.010、0.100、1.000、3.000 μmol/L）处理家兔离体空肠作为对照，重复上述步骤，并记录此时空肠平滑肌自发性收缩稳定时的张力变化。

1.7.6 FS ext对由CaCl2诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响 为确定FS ext对Ca2+内流的影响，首先让肠管处于Tyrode溶液中，待其张力稳定后，将Tyrode溶液换为含EDTA的无Ca2+高K+溶液，持续30 min以从组织中除去Ca2+。再将溶液换为不含EDTA的无Ca2+高K+溶液，持续15 min，然后再加入FS ext（0.3、1.0 mg/ml），构建CaCl2（3×10-5～3×10-2mol/L）的量-效曲线，观察给予不同剂量FS ext后家兔离体空肠平滑肌自发性收缩率的变化。在加入维拉帕米（1 μmol/L）的情况下，构建CaCl2（3×10-5～3×10-2mol/L）的量-效关系曲线，观察空肠平滑肌自发性收缩率变化。在没有FS ext和维拉帕米预处理的情况下，将3×10-2mol/L CaCl2诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩率认为是100%［12］。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，组间比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 植物化学分析

2.1.1 初步植物化学分析 对FS ext的初步植物化学分析表明其含有酚类、皂苷类和黄酮类化合物。

2.1.2 总黄酮的含量 FS ext中黄酮含量的测定表明，黄酮含量为8.13 mg/g。

2.1.3 高效液相色谱法检测FS ext中的化学成分 采用高效液相色谱法对FS ext中的化学成分进行检测，结果显示，FS ext中主要含连翘苷和连翘酯苷A。在上述1.3.3的色谱条件下，连翘苷和连翘酯苷A的分离度良好，空白、混合标准品、样品的色谱图见图1。

图1 空白（A）、混合标准品（B）、连翘叶乙醇提取物样品（C）的HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of blank（A），reference substances（B），and sample（C）

2.2 FS ext的急性毒性 在测量LD50的实验过程中，小鼠按不同剂量的FS ext进行灌胃后，在观察期内未出现任何死亡或毒性迹象。单次给予FS ext的剂量为16 g/kg，小鼠在观察期内未出现任何的死亡及行为变化。

2.3 FS ext对小鼠蓖麻油性腹泻的影响 5组初始半固体粪便时间和EI比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。阳性组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P＜0.05）；1.00 g/kg FS ext试验组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性组EI高于阳性组、1.00 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P＜0.05）；0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组EI高于阳性组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 FS ext对小鼠蓖麻油性腹泻的影响（±s）Table 2 Effect of ethanol extract from Forsythia suspensa （FS ext） on castor oil-induced diarrhea in mice

表2 FS ext对小鼠蓖麻油性腹泻的影响（±s）Table 2 Effect of ethanol extract from Forsythia suspensa （FS ext） on castor oil-induced diarrhea in mice

注：FS ext=连翘叶乙醇提取物，EI=腹泻指数；与阴性组比较，aP＜0.05；与阳性组比较，bP＜0.05；与0.25 g/kg FS ext试验组比较，cP＜0.05

组别 只数 初始半固体粪便时间（min） EI阴性组 10 65.50±35.87 16.80±4.42阳性组 10 119.50±48.50a 8.40±5.61a 0.25 g/kg FS ext试验组 10 54.90±23.30b 15.60±7.74b 0.50 g/kg FS ext试验组 10 83.10±32.69 13.90±4.32 1.00 g/kg FS ext试验组 10 104.00±40.99c 10.50±5.06 F值 4.610 3.582 P值 0.003 0.013

2.4 FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响 台氏液对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05，见图2）。FS ext对家兔离体空肠平滑肌表现出剂量依赖性解痉作用，即半最大效应浓度（EC50）=1.21 mg/ml（1.11～1.26 mg/ml，n=6），见图3。图形类似于维拉帕米（0.01～10 μmol/L），其 EC50 为 0.51 μmol/L（0.42～0.59 μmol/L，n=6），见图4。

图2 台氏液对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响Figure 2 The effect of Tyrode's solution on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

图3 不同浓度FS ext对离体空肠平滑肌自发性收缩的影响Figure 3 Effects of different concentrations of FS ext on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

图4 不同浓度维拉帕米对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响Figure 4 Effects of different concentrations of verapamil on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

2.5 FS ext对ACh和KCl诱导的家兔离体空肠收缩的松弛作用 FS ext能浓度依赖性地抑制由ACh诱导的肠管 收 缩，EC50=0.99 mg/ml（0.91～1.02 mg/ml，n=6），最大抑制率为84.75%，其量-效关系曲线变化见图5A。此外，FS ext也能够以浓度依赖的方式抑制由KCl诱导的肠管收缩，EC50=0.63 mg/ml（0.58～0.67 mg/ml，n=6），最大抑制率为91.45%，其量-效关系曲线变化见图5A。FS ext对ACh和KCl诱导的家兔离体空肠平滑肌收缩的松弛作用与维拉帕米在0.001～3.000 μmol/L时相似，EC50值分别为0.25 μmol/L（0.20～0.29 μmol/L，n=6） 和 0.041 μmol/L（0.033～0.047 μmol/L，n=6），其量-效关系曲线变化见图5B。

图5 不同浓度FS ext和不同浓度的维拉帕米对ACh（10 μmol/L）和KCl（60 mmol/L）诱导的兔离体空肠收缩的影响Figure 5 Effects of different concentrations of FS ext and verapamil on the contraction of rabbit isolated jejunum induced by ACh （10 μmol/L） or KCl （60 mmol/L）

2.6 FS ext对CaCl2诱导的空肠收缩的影响 FS ext以浓度依赖的方式抑制CaCl2诱导的肠管收缩，最大抑制率为52.13%，进一步研究发现，随着FS ext剂量的增加，形成的CaCl2量-效关系曲线向右下方移动，这与维拉帕米引起的CaCl2量-效关系曲线变化类似，见图6。

3 讨论

在蓖麻油诱导的小鼠急性腹泻模型中，蓖麻油通过刺激小肠，损伤小肠黏膜细胞，促进炎性递质合成和释放，导致肠腔内积液而出现急性腹泻；此外，蓖麻油能减少Na+和K+主动吸收，降低小肠和结肠Na+-K+ATP酶活性［13］。蓖麻油中含有的蓖麻油酸能够引起局部刺激和肠黏膜炎症，从而导致前列腺素释放，增强胃肠动力［14］。蓖麻油诱导小鼠腹泻实验中，试验组与阴性组相比，小鼠EI明显降低，初始半固体粪便时间延长。根据植物化学分析，FS ext中含有黄酮类化合物［15］。因为萜烯、黄酮类化合物和萜类化合物可以抑制自体蛋白和前列腺素的释放［16］，所以根据实验结果推测，FS ext中可能含有抑制前列腺素释放的物质，从而抑制小鼠蓖麻油性腹泻。

通过探究FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响，发现其表现出一定的剂量依赖性解痉作用，进一步印证FS ext可以抑制蓖麻油诱导的小鼠腹泻。ACh是肠神经系统中主要的兴奋性神经递质［17］，可通过激活毒蕈碱受体（M受体）诱导平滑肌自发性收缩。肠神经系统的副神经系统和内在神经元通过释放ACh、激动肠平滑肌细胞膜上的M受体而增加其收缩活性，促进肠道蠕动［18］。在FS ext对ACh诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩影响实验中，FS ext试验组空肠收缩变化率呈下降趋势，与维拉帕米组的实验结果一致，提示FS ext能够舒张ACh诱导的离体空肠平滑肌自发性收缩，因此FS ext舒张肠平滑肌的作用可能与阻断M受体有关。平滑肌的收缩取决于细胞质中Ca2+的存在，细胞外的Ca2+通过细胞表面的L-型钙离子通道进入细胞内，或是通过细胞内肌浆网释放Ca2+，从而使得细胞内Ca2+升高［19］。因此，钙通道的阻断或是细胞内储存的Ca2+释放量减少均会减弱平滑肌的收缩。在细胞兴奋过程中，L-型钙离子通道可调节细胞内Ca2+浓度保持在参考范围，即钙稳态的主要离子通道［20］。由之前的文献可知，高浓度的K+水平可打开电压依赖性L-型钙离子通道并允许细胞外Ca2+进入细胞内，从而促进肠平滑肌的收缩［21-22］。FS ext可松弛高K+诱导的肠平滑肌自发性收缩，提示可能有钙拮抗剂的存在［23］。因此，为验证这一猜想，本实验使用KCl溶液诱导肠管收缩，并将维拉帕米作为对照组，维拉帕米是一种L-型钙离子通道阻断剂［24］。实验结果显示，FS ext能松弛KCl诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩，且随着FS ext浓度的增加，形成的CaCl2量-效关系曲线向右下方移动，这与维拉帕米引起的CaCl2量-效关系曲线变化类似。提示FS ext抑制家兔离体空肠平滑肌的收缩可能与阻断L-型钙离子通道有关。

综上，FS ext有明显的抗小鼠蓖麻油性腹泻作用，可抑制家兔离体空肠平滑肌的自发性收缩和ACh和KCl诱导的空肠收缩，其机制可能与阻断M受体和抑制L型-钙离子通道有关。

作者贡献：陈贵宇进行文章的构思与设计，文献资料收集、整理，撰写论文，论文的修订并对文章负责；李春臣进行数据的整理，文章中图表的绘制，论文的修订；辜春霞、杨晨、江兰进行研究实施，数据收集；罗涛、梅雪进行数据提供，质量控制；张建武负责文章的质量控制与审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。