王 峥苗晋鑫

(河南中医药大学,中医药科学院,郑州 450000)

黑色素瘤是皮肤中产生色素的黑素细胞的恶性肿瘤,其特征是高度侵袭和远端器官转移[1]。黑色素瘤的发病率逐年上升,远超其他癌症[2]。尽管黑色素瘤治疗方法取得了进展,但预后仍然很差,转移的患者生存期仅6～9 个月,5 年的生存期不及5%[3]。研究肿瘤发病机制、浸润转移及药物的治疗反应对改善肿瘤患者预后至关重要[4]。小鼠模型是临床前应用最广泛的动物模型,其为研究黑色素瘤的发病机制、转移及药物评价的重要工具。黑色素瘤小鼠模型可分为诱发性模型、移植性模型、转基因模型[5-7]。通过紫外线或致癌物诱发小鼠模型,确定黑色素瘤发生的易感性和风险因素。同种移植模型将黑素瘤细胞移植到相同的物种和遗传背景中,由于动物在这种模型中具有功能性免疫系统,用于评估癌症与免疫细胞之间免疫疗法以及相互作用。异种移植模型将人黑素瘤细胞植入免疫缺陷小鼠中,以快速识别造成恶性肿瘤的关键途径。基因表达经过修饰的转基因小鼠来确定黑色素瘤的发生机制,用于阐明基因功能并确定治疗的关键靶点。每种模型都揭示了黑色素瘤的独特见解,本文总结近20 年黑色素瘤小鼠模型研究,总结和比较分析黑色素瘤小鼠模型的制备、表型、优缺点及适用范围,为优化黑色素瘤小鼠模型及增进我们对疾病的了解并推动治疗的发展提供科学依据。此外,小鼠黑色素瘤模型仍需要更广更深的拓展,对已报道的模型结合其本身特点及多学科知识的叠加运用,建立更加符合人类临床的动物模型并获取更准确的研究结果。

1 诱导性模型

1.1 紫外线诱导的小鼠模型

通过紫外线照射获得的黑色素瘤模型被认为是临床上可靠的模型[8]。UV 在黑色素瘤小鼠中为强诱导剂,在黑色素存在的情况下,可导致更早和更多的肿瘤形成。除直接诱变作用外,UV 可诱导角质细胞损伤导致暴露于UV 小鼠的Myd88 TLR4+中性粒细胞增加。Myd88/TLR4 中性粒细胞可在体内和体外增强小鼠或人黑色素瘤细胞的血管养分,通过影响微环境来增强黑色素瘤的产生[9]。但暴露于紫外线(短期或较低剂量)的成年小鼠表皮是很难形成黑色素细胞特征[10]。最近的研究表明DNA 损伤需要存在其他失调的基因(通过表观遗传事件)来启动紫外线诱导的黑色素生成[11]。Noonan等[12]将HGF/SF cDNA 表达的小鼠置于日光灯下用不同剂量(6.24 kJ/m2UVB、3.31 kJ/m2UVA、0.03 kJ/m2UVC)进行紫外诱导15 min。诱导后的小鼠出现皮肤发红,偶有浅表皮脱屑,在组织病理学中观察到小鼠产生的大多数皮肤黑色素瘤中具有真皮成分,病变显示具有垂直生长期或浸润性恶性黑色素瘤以及淋巴结转移,这些病变与人类患者黑色素瘤页面状扩散的表皮内病变特征相似[13]。这种实验性小鼠模型中黑素细胞瘤病因、组织病理学和分子排列等方面类似于人黑色素瘤。单独和协同作用的遗传和环境等危险因素的评估提供了研究平台,有望利用这种模型有效促进防晒策略和黑色素瘤治疗[14]。但野生型或正常型小鼠一般不易发生UV 诱导的黑色素瘤,因此UV 诱导的黑色素瘤小鼠模型往往需要联合免疫缺陷小鼠,其操作技术较难、成本较高。

1.2 化学诱导

化学致癌物诱导黑色素瘤小鼠模型大多采用DMBA 和TBA 诱导。DMBA 是一种免疫抑制多环芳烃,其致癌机理是其活性代谢物被CYP450 代谢成致癌物1,2-环氧化物-3,4-二醇DMBA,进而损伤DNA[15]。TPA 是通过激活蛋白激酶C 充当肿瘤启动子,进而使一些生长因子受体磷酸化[16]。Elmets 等[17]用100 μL 的0.1%、0.5%、1%的DMBA的丙酮溶液涂抹于6 周龄雌性C3H/Hen 小鼠已剃毛的背部皮肤。在DMBA 涂抹一周后,每周两次将TPA(40 nmol)施用到相同部位。几周后,小鼠背部皮肤上出现色素沉着斑点。组织学研究表明,小鼠真皮组织中色素细胞积累,某些色素细胞表现出嵌套的形态学模式。此类模型可用于研究阳光对黑素细胞痔转化为侵袭性的黑色素瘤的过程中起的作用。由于小鼠模型的免疫系统功能全面,因此也可以用于研究免疫治疗策略。但是,化学诱导黑色素瘤小鼠模型缺乏与人类疾病的临床相关性。

2 移植性模型

移植模型是目前应用最多的肿瘤模型,即用肿瘤组织或细胞(动物或人)移植到动物体内所形成的肿瘤动物模型[18]。我们根据移植物来源,即同种移植模型和异种移植模型进行总结分析(表1)。

2.1 同种移植模型

同种移植模型是将小鼠黑素瘤细胞接种到具有相同遗传背景的小鼠中获得小鼠黑素瘤模型[19]。此模型包括ICR 小鼠的Harding-Passey 黑色素瘤模型、DBA 小鼠的S91 黑色素瘤模型、C57BL/6 小鼠的B16 黑色素瘤模型,其中C57BL/6 小鼠的B16 黑色素瘤是最常用模型[20]。同种移植模型具有免疫能力,可通过黑色素细胞与免疫细胞之间固有的相互作用来研究黑色素瘤与微环境的关系。然而,该移植模型的原发肿瘤出现与转移发生之间时间间隔短,不利于药物药效研究;且肿瘤细胞为鼠源,与人类肿瘤有一定的差异[21]。

表1 黑色素瘤小鼠动物模型比较Table 1 Comparison of mouse animal models of melanoma

2.1.1 同种移植皮下模型

将C57BL/6J 小鼠皮下移植5×105的B16-OVA黑色素瘤细胞,成功建立黑色素瘤皮下移植瘤模型,用于评价VSV-GP-GFP 的治疗效果[22]。姚香利等[23]分别采用从小鼠中提取原代肿瘤细胞及体外培养的B16 细胞植入C7BL/6 小鼠体内,接种后小鼠均出现了精神萎靡、食物摄入量减少、毛发粗糙等特征。该研究表明,原代细胞接种的小鼠黑色素实体瘤生长速度较快,成瘤率较高,可用于体内筛选和评价特定化合物抗肿瘤活性。Soica 等[24]对8周大的C57BL/6J 雌性小鼠皮下接种B164A5 细胞,并给予GCDG 复合物治疗。研究发现,治疗组在肿瘤体积和重量方面明显降低。组织病理观察发现,未治疗组肿瘤病变较重,具有高度增殖性。B164A5细胞系是可导致色素沉着过度的彩色鼠黑色素瘤细胞类型之一,可引起小鼠模型产生红斑。因此,此模型也可用于研究皮肤血红蛋白水平与肿瘤发展的相互关系。

2.1.2 同种移植转移模型

孟星君等[25]比较了尾静脉注射、腹腔注射和皮下注射等不同方式给C57BL/6 小鼠接种B16 F10细胞,结果发现只有尾静脉注射方法接种肿瘤的小鼠出现了肺部转移现象。Gheorgheosu 等[26]向C57BL/6 小鼠腹膜内接种B16 黑色素瘤细胞,接种后小鼠的皮肤、肺、肝和脾等不同器官出现肿瘤转移现象。皮肤病理学显示肿瘤由圆形和椭圆形的肿瘤细胞组成。肺部血管出现大量肿瘤增殖并伴随支气管炎症,肝出现了中度瘀滞和点状肿瘤。因此不同接种部位通常会改变肿瘤的生长特性[27]。此小鼠模型与人类黑色素瘤临床转移十分相似,操作简单,重现性好,可用于评估药物抗黑色素瘤转移作用。但与人类黑色素瘤相比,小鼠细胞系的黏附蛋白和生长因子有较大不同,因此无法完全代表人类疾病[21]。

2.2 异种移植模型

异种移植模型是将人类的肿瘤细胞或组织移植入免疫缺陷型实验动物体内[28]。此模型一般采用免疫缺陷型小鼠,例如无胸腺裸鼠、CB17-SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG 小鼠。一般来说,免疫缺陷程度越高,成瘤性越好。癌症的相关研究中,人源细胞系异种移植(cell-line-derived xenograft,CDX)模型和患者肿瘤组织异种移植(patienT--derived xenograft,PDX)模型已得到广泛应用[29-30]。异种移植模型的建立依赖于受体动物免疫功能的缺失。异种移植的优势在于肿瘤与皮肤转移发展时间较长,允许人类黑素瘤细胞与鼠基质、淋巴管相互作用,便于评估肿瘤的生长行为及抗癌药的体内反应。但是,这类模型有一些限制,因为小鼠免疫功能低下,不能用于检查免疫疗法的功效[31]。

2.2.1 CDX 模型

将5×106的人A375 黑色素瘤细胞皮下注射NOD/SCID 小鼠腹侧的双侧,成功构建黑色素瘤CDX 模型,用于评价VSV-GP-GFP 的治疗效果[32]。Liang 等[33]向无胸腺裸雌鼠皮下接种人A375 黑色素瘤细胞,并给予伊曲康唑口服溶液治疗。研究发现,伊曲康唑可以抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤扩散。Gowda 等[34]将1ⅹ106的UACC 903 细胞或1205 Lu细胞皮下注射4～6 周龄雌性Athymic-Foxn1nu 裸鼠,并给予 CelePluM-777 治疗。研究发现,CelePluM-777 可通过COX-2 和STAT3 协同抑制异种移植的黑色素瘤肿瘤生长并对其它细胞无毒性。Hubmann 等[35]采用具有BRAF V600E突变和CDKN2A外显子2 缺失的黑色素瘤细胞系518A2,皮下接种雌性无胸腺裸鼠,建立异种黑色素瘤小鼠模型并给予胶质毒素治疗。小鼠治疗后发现肿瘤体积明显减小并发现胶质毒素治疗恶性肿瘤与NOTCH2 相关。

2.2.2 PDX 模型

Hoffman 等[36]将75 岁女性患者胸壁中BRAFV600E突变片段的黑色素瘤组织移植到裸鼠的胸壁以模仿从患者身上切除的部位。此模型是通过将人类肿瘤组织异种移植到免疫功能低下的小鼠体内而开发的,以解决各种恶性肿瘤的病因和药物研究。模型由于可以维持肿瘤异质性、基因维持,整体通路活性和突变状态的能力及较长模型寿命,因此可以发展为大型临床试验样研究来研究新药和抗癌疗法[37]。Yan 等[38]将93 个新鲜的患者肿瘤组织切成2×2×2 mm3碎片的大小,皮下接种6 周大的NOD/SCID 雌性小鼠,建立PDX 模型。实验结果发现,模型成功植入率为26.9%,保留了病人的肿瘤组织学和遗传学特征,可模拟溃疡状态对人类黑色素瘤预后的影响。通过优化方法,PDX 模型可以保留突变特征并保留其亲代肿瘤对应物的组织学特征,应将这些模型视为其他临床前模型的补充并用于开发个性化靶向疗法。研究发现肿瘤样品的来源和原发肿瘤的临床分期是成功建立PDX 模型的两个重要因素。然而,此模型移植后的潜伏期长,连续传代后鼠基质被人类基质替代,移植率可变,免疫系统受损,有移植物抗宿主病的可能性以及某些免疫细胞功能的缺乏[39]。

3 转基因小鼠模型

人类黑素瘤中已发现许多遗传和表观遗传异常[40-41]。致癌基因或抑癌基因的突变导致肿瘤的发生和发展。小鼠基因编辑技术较成熟,容易获得基因工程小鼠。可以通过异位表达癌基因,引入特定的致癌突变或灭活肿瘤抑制基因来对小鼠进行转基因黑色素瘤模型的构建。转基因小鼠对黑色素瘤发生的分子途径的理解有重要意义[42]。此外,转基因小鼠是可靠且可重现的模型,用来评估受损基因对黑色素瘤生物学的影响。此类模型较多,本文主要探讨以下几种常用模型,并对其病理特征、稳定性及造模时应注意的问题进行总结(表2)。

表2 黑色素瘤小鼠模型病理表现、模型稳定性及注意事项总结Table 2 Summary of pathological manifestations,model stability and precautions of melanoma mouse models

3.1 Lum-/-基因敲除小鼠

Lumican 是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan,SLRP),为胶原原纤维形成的关键调节剂。黑色素瘤中Lumican 表达降低与浸润相关[43]。Chakravarti 等[44]利用BamHI 建立的克隆衍生物导入胚胎干细胞,建立Lum-/-转基因小鼠。此小鼠模型证明Lumican 是黑色素瘤肿瘤生长的内源性抑制剂,可促进黑色素瘤细胞粘附,同时抑制其迁移能力[45]。该模型可提供与肿瘤发生和转移相关机制及可见性肿瘤病变的进展,以及确定负责的黑色素瘤进展的基因。

3.2 Tyr:: N-RasQ61 K转基因小鼠

Ackerman 等[46]使用突变的人N-RasQ61K和SV40 剪接以及聚腺苷酸化序列生成Tyr::NRasQ61K构建体,并注射到卵母细胞中,建立Tyr::N-RasQ61K转基因小鼠。研究发现,小鼠具有表皮增生,过度角化和黑色素沉积等特征并伴随有肺、肝及淋巴结肿瘤转移。当Tyr::N-RasQ61K转基因小鼠进入到Ink4a/ Arf-null背景时,能明显促进黑色素瘤的发生。这是由于INK4a/ARF 基因功能失活是人类黑色素瘤的最常见因素之一,其编码产物为P16INK4a 和 P19ARF[47-48]。但只有当缺乏P16INK4a 和保留P19ARF 的小鼠才显示出致癌物对转移性黑色素瘤的易感性[49-50]。转基因小鼠中的黑素细胞中H-ras 基因突变,可促进黑素细胞的增生、皮肤色素沉着。在Tyr::N-RasQ61K转基因小鼠中抑制INK4a/ARF 活性可促使结节性黑色素瘤的产生[51]。

3.3 BrafV600E转基因小鼠模型

Dhomen 等[52]使用LoxP-stop-LoxP(LSL)/Cre重组酶技术从内源性Braf基因中诱导BrafV600E表达,建立BrafV600E转基因黑色素瘤小鼠模型。BrafV600E表达可诱导小鼠形成由色素上皮样或树突状黑素细胞组成的痣,其中大约有70%的BrafV600E小鼠会发展成黑色素瘤。此模型可模拟人类黑色素瘤的组织和分子特征。附加基因改变可使BrafV600E小鼠发展为黑色素瘤,沉默PTEN基因可使黑色素瘤发生转移。Dankort 等[53]建立BrafV600E与PTEN沉默协同诱导的黑色素瘤小鼠模型,小鼠出现局灶型转移黑色素瘤,真皮中的黑色素瘤有浸润到皮下组织的迹象,并且所有小鼠的黑色素瘤都已扩散到淋巴结中。此模型可用于研究关键基因的信号转导,并评估靶向相关途径的药物影响,有助于开发治疗黑色素瘤的靶向药物。

4 讨论

黑色素瘤的发病率逐年上升,其发病机制复杂,并且发现时多已转移,尚无有效的治疗手段。黑色素瘤小鼠模型在研究黑色素瘤发生发展机制和治疗药物研究中起着关键作用[54]。目前已有三种不同的黑色素瘤小鼠模型,但由于实验动物与人类基因组、基因调控、细胞类型、器官结构与组成等方面是有一定差别,这些模型预测药物治疗临床疗效的能力有限。因此,要根据各种动物模型的特点、适用范围及研究目的来考量,以选择和建立理想的动物模型[55]。诱导的小鼠模型模拟人类受外界因素影响获得的黑色素瘤,常用于研究预防黑色素瘤形成。移植接种的黑色素瘤小鼠模型概括了黑色素瘤原位发展、转移的一些特点,多用于抗肿瘤和转移药物评估。基因工程小鼠模型可用于研究特定基因组改变在黑色素瘤的发生和发展的重要性及药物的靶向治疗。根据实验目的并结合模型优缺点选择合适小鼠模型。通过深入研究和技术完善建立良好的黑色素瘤小鼠模型,以便对黑色素瘤发病机制和相关治疗药物的研究。此外,在构建黑色素瘤小鼠模型研究中小鼠和人之间的差异性也应当考虑,例如小鼠的免疫系统及代谢等方面与人类有一定的差距,提示我们可以进一步研究人源化小鼠模型用于黑色素瘤模型的构建。总之,继续探究合适黑色素瘤小鼠模型,人们将逐渐发现肿瘤的发展机制、与宿主之间的关系、侵袭和转移的过程,进而找到有效的治疗方法。