张丽凤余双全梁祚仁莫颂轶黄彦峰黎 昀廖素婵庞艳芳黄俊杰

(右江民族医学院,广西百色 533000)

酒精滥用所致疾病已成为当今社会的公共卫生问题。酒精是一种亲脂性的小分子,其可以通过血脑屏障到达脑组织,并与细胞膜的受体结合从而改变神经细胞功能,进而影响记忆和认知功能。尽管酒精中毒所致认知障碍及脑损伤等方面的研究取得了一定的进展,但迄今为止酒精中毒所致认知障碍的确切发病机制尚未完全阐明。海马神经元突触可塑性被认为是学习和记忆的神经生物学基础,当受外界环境影响时,神经系统可塑性也发生变化,突触可塑性分为形态结构可塑性和功能可塑性。研究表明五味子乙素(schisandrin B,Sch B)具备了抗氧化,保护脑组织,改善学习记忆的能力,但Sch B 对慢性酒精中毒大鼠学习记忆影响的领域未见相关的研究报道。本研究旨通过建立慢性酒精中毒大鼠模型,用Sch B 干预治疗,探讨Sch B 对慢性酒精中毒致大鼠海马突触超微结构损伤的改善作用,并阐明其相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

从湖南省长沙天勤生物技术有限公司[SCXK(湘)2019-0014]购买25 只成年清洁级Wistar 大鼠,雄性,6 周龄,体重180～200 g。动物实验在右江民族医学院实验动物中心进行[SYXK(桂)2017-0004],本研究遵循实验动物使用的3R 原则,经右江民族医学院实验动物伦理委员会审批同意批准后(IACUC2020010501)实施,并严格按实验动物安全制度及相关规章执行。

1.2 主要试剂与仪器

五味子乙素购买于维克奇生物科技公司(批号:wkq19101401);电镜固定液购买于Servicebio 公司(货号:G1102);812 包埋剂SPI 公司(货号:90529-77-4);透射电子显微镜(日本HITACHI 公司);Morris 水迷宫(北京新天地科技有限公司);超薄切片机(德国Leica 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 慢性酒精中毒模型建立和动物分组

以白酒(56°北京红星二锅头)连续灌胃大鼠8周,建立慢性酒精中毒动物模型[1],以8 mL/(kg·d)作为起始剂量灌胃,后每周增加1mL,至第3 周增加到10 mL/(kg·d)的剂量,第4 周增至12 mL/(kg·d)的灌胃剂量并一直按此剂量连续灌胃到第8 周。然后对模型组进行酒精戒断24 h 后评分,判断慢性酒精中毒模型建立是否成功[2]。将慢性酒精中毒模型建立成功的大鼠随机分为分成4 个组,即模型组(n=5 只)、Sch B 低剂量组(n=5 只)、Sch B 中剂量组(n=5 只)、Sch B 高剂量组(n=5 只),Sch B 各剂量组用Sch B 灌胃,每天1 次,各组的Sch B 剂量分别为10、20、40 mg/kg 体重,连续30 d。另选取5 只每天灌胃蒸馏水,作为空白对照组。大鼠在室温(25±1)℃、湿度50%～60%环境下分笼饲养,自由饮水。

1.3.2 Morris 水迷宫实验

动物模型建立成功后,用Morris 水迷宫检测酒精中毒模型大鼠学习与记忆能力(包括定位航行实验和空间探索实验),先对大鼠进行定位航行获得性训练,每天定位训练4 次,即在4 个不同的象限都各训练一次。定位航行实验完成后再进行空间探索实验,将水下平台撤除,任意选取1 个入水点,所有动物均为同一入水点,将动物面向池壁轻轻放入水中,动物落水后游泳时间以60 s 为限,记录动物在此时间内首次跨越平台所用时即潜伏期以及跨越平台次数等指标。

1.3.3 动物样本取材

大鼠进行Morris 水迷宫实验后,用20%氨基甲酸乙酯按5mL/kg 剂量进行腹腔注射,麻醉成功后,立即断头取脑,定位取海马CA1 区,将分离的组织块投放到电镜固定液中,在4℃条件下固定4 h。

1.3.4 透射电子显微镜观察海马CA1 区突触超微结构

固定的海马组织,经脱水、渗透、切片、铀铅双染色后,应用透射电子显微镜观察各组大鼠海马CA1区神经元超微结构的改变,同时电脑采集图像,观察海马神经元突触数目及测定海马突触结构的形态参数(突触后膜致密物质厚度、突触间隙宽度)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 Morris 水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力

Morris 水迷宫实验结果显示,酒精中毒模型组空间探索实验潜伏期比空白对照组的空间探索实验潜伏明显变长,而平台穿越次数减少(P<0.05);与酒精中毒模型组比,Sch B 低剂量组、Sch B 中剂量组、Sch B 高剂量组空间探索实验潜伏期均缩短,而平台穿越次数增多,以Sch B 高剂量组变化明显(P<0.05)(见表1)。

2.2 透射电镜观察各组大鼠海马CA1 区突触的超微结构改变

与空白对照组比较,神经元细胞呈重度水肿,大面积细胞膜破损,细胞器游离;细胞核呈不规则形固缩,局部凹陷,异染色质边集,核周隙明显增宽;线粒体呈明显肿胀,大多线粒体膜内基质变淡,嵴断裂、消失;粗面内质网明显扩张,脱颗粒,空泡变。与酒精中毒模型组比较,五味子乙素低、中、高剂量组细胞水肿逐渐减轻,细胞膜局部小面积破损;随着五味子乙素剂量增加,细胞损伤程度降低,细胞质丰富,细胞膜渐完整;细胞核呈不规则形,染色质均匀,核膜清晰、完整;线粒体呈轻度肿胀,大多数线粒体嵴存在,膜完整,少量线粒体膜内基质变淡;粗面内质网轻微扩张(见图1)。

2.3 透射电镜测定各组大鼠海马CA1 区突触数及突触结构形态参数

通过透射电镜对海马CA1 区突触数量、突触间隙宽度、突触后致密物质厚度进一步统计分析,结果显示,与空白对照组相比,酒精中毒模型组突触数量减少,突触间隙变宽,突触后膜致密物质不均变薄,差异具有统计学意义(P<0.05);与酒精中毒模型组相比,Sch B 低、中、高剂量组突触数量增加,突触间隙清晰缩短,突触后致密物质增厚,差异具有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表1 Morris 水迷宫空间探索实验潜伏期和平台穿越次数实验结果(,n=5)Table 1 Experimental results of Morris water maze space exploration experiment incubation period and platform crossing times

表1 Morris 水迷宫空间探索实验潜伏期和平台穿越次数实验结果(,n=5)Table 1 Experimental results of Morris water maze space exploration experiment incubation period and platform crossing times

注:与空白对照组比较,∗P<0.05;与酒精中毒模型组比较,#P<0.05。Note.Compared with the blank control group,∗P<0.05.Compared with the alcoholism group,#P<0.05.

3 讨论

酒精滥用所致疾病已成为当今社会的公共卫生问题。酒精是一种亲脂性的小分子,其可以通过血脑屏障到达脑组织,并与神经细胞膜的受体结合从而改变神经细胞功能,进而影响记忆和认知功能[3-4],长期饮酒过度可诱发慢性酒精中毒并导致认知障碍及脑损伤。本研究结果显示,慢性酒精中毒大鼠空间探索实验潜伏期比正常大鼠的空间探索实验潜伏期明显变长,规定时间内跨越平台次数减少,说明酒精中毒大鼠的学习记忆能力明显下降,与报道的研究结果一致[5-6]。酒精中毒所致认知障碍及脑损伤等方面已经得到公认,且其研究也取得了一定的进展,但迄今为止酒精中毒所致认知障碍的确切发病机制尚未完全阐明。

突触是神经元之间信息传递和加工的部位,而突触可塑性是学习和记忆的生理学基础[7]。海马神经元突触可塑性则是学习和与记忆的神经生物学基础,突触可塑性分为形态结构可塑性和功能可塑性,突触形态结构可塑性是指突触结构形态、突触密度的改变以及新突触形成[8-10],其与学习记忆密切相关[11],体内外各种因素的改变可使突触形态结构可塑性随之发生改变。本研究结果显示,慢性酒精中毒大鼠海马组织神经细胞水肿,细胞核肿胀,细胞器减少,线粒体明显肿胀;突触小体肿胀严重,间隙变宽,突触后膜致密物质不均,突触数量明显减少。因突触间隙内含有大量的降解酶,能够分解神经递质,因此在神经递质传递过程中若突触间隙越宽,神经递质从突触前膜释放跨越间隙与后膜受体结合所需的时间越长,在间隙中传导被降解的量越多,影响信息传递,突触后致密物质变薄反应了附着在后膜上的致密物质蛋白减少,而在神经递质传递过程中需要蛋白的参与,蛋白的减少可能使神经递质的传递速度减慢,消耗更多[12-13]。说明慢性酒精中毒可引起神经元损害、突触可塑性降低造成学习记忆障碍发生。

图1 透射电镜观察各组大鼠海马CA1 区突触的超微结构Note.A,Blank control group.B,Alcoholism group.C,Low-dose Sch B group.D,Medium-dose Sch B group.E,Highdose Sch B group.Figure 1 The ultrastructure of neurons in hippocampal CA1 area were observed by transmission electron microscope

表2 各组大鼠突触数量和突触结构参数(,n=5)Table 2 Number of synapses and structural parameters of synapses in each group

表2 各组大鼠突触数量和突触结构参数(,n=5)Table 2 Number of synapses and structural parameters of synapses in each group

注:与空白对照组比较,∗P<0.05;与酒精中毒模型组比较,#P<0.05。Note.Compared with the blankcontrol group,∗P<0.05.Compared with the alcoholism group,#P<0.05.

目前,慢性酒精中毒引起学习记忆障碍的发病率逐年升高,但临床上尚缺乏治疗酒精中毒的特效药,这就给酒精中毒导致学习记忆障碍的防治带来了一定的困难,因此,寻找有效防治慢性酒精中毒学习记忆障碍药物意义重大。Sch B 是五味子中含量最高的木脂素,近年来Sch B 改善学习记忆能力方面的研究有所增多,有研究报道Sch B 具有抗氧化,保护脑组织,改善学习记忆的能力[14-15];也有研究认为Sch B 能调控神经元的同步活动从而保护神经元[16-17],但Sch B 对慢性酒精中毒大鼠学习记忆的影响未见相关的研究报道。本研究通过Sch B 干预后,发现大鼠空间探索实验潜伏期缩短,跨平台穿越次数增多,且高剂量组表现更加明显,说明在慢性酒精中毒导致的学习记忆障碍基础上给予Sch B 治疗,其发挥了较为明显的改善作用,随着给药剂量的增加,改善作用更加明显。通过透射电镜观察发现Sch B 干预治疗后神经元胞质丰富,细胞器增多,细胞损伤程度降低;突触小体水肿程度较低,突触间隙清晰,宽度变窄,突触后致密区增厚,突触界面较长,突触数量增加。

综上所述,Sch B 可通过改变大鼠海马CA1 区神经元突触超微结构,促进神经细胞突触可塑性,从而提高慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力。但其具体的分子机制有待于进一步研究。