杨灿 沃恩康 杨新燕 徐琦 杨柳 邓冠聪 路鑫怡 郭潮潭

杭州医学院生物工程研究所310013

甲型流感病毒极易变异，宿主广泛，能通过呼吸道在人群中迅速传播，引起全球范围内的季节性大流行[1]。 甲型流感病毒感染会导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成黏膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其他上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则能引起毛细支气管炎和间质性肺炎，严重的肺损伤可导致器官衰竭或死亡，这也是感染者死亡的主要原因[2]。现阶段针对甲型流感病毒所致严重性肺炎最主要的防控措施依然是提前接种疫苗。 尽管接种疫苗和抗病毒药物对流感有效，但鉴于流感病毒株的易突变特性，探索它们引起肺损伤的共同机制，能为更有力的预防和更为精准的治疗提供依据。 Gene Expression Ominbus（GEO）是一个公共的基因组学研究数据库，包含了大量的基因表达、芯片和微阵列数据。 本研究拟运用GEO 数据，采用生物信息学方法分析甲型流感病毒所致肺损伤的可能机制，现报道如下。

资料与方法

一、微阵列资料数据获取

从GEO 中筛选并下载3 个基因表达数据集：GSE57455、GSE63786 和GSE64800。GSE57455 包含3 个未感染和3 个感染A/Hong Kong/X31（H3N2）病毒的肺组织样本；GSE63786 包含3 个未感染和3个感染A/California/04/09 （H1N1） 病毒的肺组织样本；GSE64800 包含3 个未感染和3 个感染A/Hong Kong/213/03（H5N1）病毒的肺组织样本。

二、方法

1.差异表达基因（DEGs）数据处理

使用NCBI 官方数据分析工具GEO2R（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R） 对感染和非感染甲型流感病毒的肺组织样本进行DEG 分析。 以P＜0.01 且| logFC |≥1 作为筛选的前置标准。

2.蛋白质相互作用（PPI）网络和模板分析

Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes（STRING）是一个用于评估PPI 的开源检索工具。 通过导入筛选出的差异基因构建蛋白互作网络。将PPI 以及差异基因数据导入Cytoscape 进行基因的上下调标注， 并通过Cytoscape 的MCODE 插件， 以Degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，kscore=2，Max.Depth=100 进行参数设置，筛选出最为显著的PPI 模块。

3.Gene Ontology（GO）及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析

通过使用在线数据分析工具DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/） 对筛选出的差异基因进行GO 及KEGG 富集分析。 所得数据通过R3.51 软件绘制图形。

4.关键基因与生物学功能分析

利用Maximal Clique Centrality（MCC）算法，筛选出最为显著的关键基因， 并通过STRING 在线工具获取关键基因的全名及生物学功能信息。 使用Cytoscape 的 Biological Networks Gene Oncology（BiNGO）（version 3.0.3） 插件对关键基因进行生物学过程分析并进行可视化作图。

结 果

一、DEGs 基因的鉴定与显著模块分析

通过GEO2R 在线分析工具检测GSE57455、GSE63786 和GSE64800 的DEGs。如图1所示，其中GSE57455 得到1132 个差异基因，GSE63786 得到1940 个差异基因，GSE64800 得到1176 个差异基因， 三者取交集得到119 个差异基因。 在这119个差异基因中（图1），显示有13 个下调基因（蓝色），106 个上调基因（红色）。 筛选出的最为显著的PPI 模块包括27 个上调基因（图1）。

图1 甲型流感病毒差异表达基因

二、GO 富集分析

如图2 显示，DEGs 显著富集于免疫应答、细胞分裂、 核分裂、 有丝分裂及M 期等生物学过程中（BP）；显著富集于细胞外间隙、胞外区部分、微管及细胞骨架、纺锤体等细胞组成上（CC）；显著富集于趋化因子活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、半胱氨酸型内肽酶活性和微管运动活性等分子功能上（MF）。

三、KEGG 富集分析

如图3 显示，DEGs 显著富集于细胞因子及受体相互作用信号通路、 趋化因子信号通路、 胞浆DNA传感通路、Toll 样受体信号通路、 卵母细胞减数分裂通路、孕酮介导的卵母细胞成熟通路、肠免疫网络用于IgA的产生通路、NOD 样受体信号通路、p53 信号通路、T 细胞受体信号通路、 细胞周期原发性免疫缺陷信号通路、细胞黏附分子（CAMs）信号通路。

四、关键基因及其生物学功能分析

经过MCC算法获得了7 个关键基因，包括FIGNL1、GBP5、ICOS、ARG1、IRF7、CYSLTR1 和SLMAF8。 对这7 个基因进行生物功能学分析结果见表1 和图4，显示它们显著富集于精氨酸代谢过程、谷氨酰胺家族氨基酸代谢、尿素代谢过程、尿素循环、细胞酰胺代谢过程、酰胺生物合成过程、Ⅰ型IFN 的生物合成过程、细胞因子生物合成过程、调节血管收缩、血管收缩的积极调节、免疫系统过程、对刺激的反应、B 细胞介导的免疫、免疫球蛋白介导的免疫应答。

图2 甲型流感病毒差异表达基因的GO（Gene Ontology）富集分析

图3 甲型流感病毒差异表达基因的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

讨论

甲型流感是引起严重病毒性肺炎肺损伤最常见的原因，并且由于其传播快速，高发病率和高死亡率的特点，给医疗资源和人民健康带来了巨大的威胁[3]。 本研究共筛选出了119 个DEGs，其中上调的基因有106 个，下调的基因13 个。DEGs 的GO 富集显示，甲型流感引起的肺损伤与免疫应答，细胞分裂、趋化因子的激活和胞外区的生物学过程极度相关。 细胞分裂可能与病毒感染后各种免疫细胞的增殖有关[4]。 胞外区的生物学过程可能是病毒可以通过利用上皮细胞表面的糖蛋白血凝素附着于胞外区唾液酸受体，从而被内吞进入细胞[5]。

表1 甲型流感病毒关键基因的功能

图4 甲型流感病毒关键基因的生物学功能分析

KEGG 通路富集显示DEGs 显著富集于细胞因子和细胞因子受体信号通路，可见，虽然甲流引起的肺损伤是病毒性的， 但本质上是属于炎症范畴，其最重要的特征就是炎性细胞因子的产生。 此外，我们共筛选出了7 个关键基因， 分别是FIGNL1、GBP5、ICOS、ARG1、IRF7、CYSLTR1 和SLMAF8。FIGNL1 是参与同源重组修复的重要分子[6]，我们发现在甲型流感病毒感染的小鼠肺组织中FIGNL1 表达上调，表明病毒感染导致肺组织中细胞DNA 受损。GBP5 是一种IFN 诱导因子， 近年来发现在病毒感染后升高，在机体中发挥着重要的抗病毒作用[7]；另一方面，GBP5 也能激活促炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8 和COX-2 的表达，这也可能是甲型流感病毒感染后引起肺损伤的重要途径之一。 IRF7 是Ⅰ型IFN产生的主要调节剂，在抗病毒应答中发挥着重要作用。有报道称IRF7 在病毒感染后引起的炎症反应中发挥着调节作用，IRF7 与CC 趋化因子（CCL7）的协同作用可能调节着肺巨噬细胞的促炎活性与其抗病毒能力之间的平衡[8]。ARG1 表达于肺和肠道的异性先天性淋巴细胞（ILC2），是调节肺组织稳态的一个重要因子[9]，ARG1 介导的精氨酸代谢分解产生的NO 是重要的炎性因子[10]。 同时，研究表明ARG1 通过调节ILC2 细胞参与炎症反应，敲除小鼠的ARG1基因可以抑制ILC2 的增殖并可通过抑制细胞因子的产生而清除肺炎[11]。

ICOS 是CD28 超家族的诱导共刺激分子之一，可以通过上调趋化因子受体CCR3、CCR4 和CCR8的信号来促进肺组织的黏膜炎症反应[12]。 而KEGG通路富集也显示，DEGs 显著富集于趋化因子信号通路， 这表明ICOS 驱动的趋化因子信号通路在甲型流感所引起的肺损伤中扮演着十分重要的角色。CYSLTR1 作为一种促炎性因子，与气道及肺部炎症相关，其拮抗剂能明显改善哮喘及其引起的肺功能障碍[12]。 SLAMF8 虽然是淋巴细胞活化分子（SLAM）家族的一员[13]，但越来越多的证据表明，SLAM 家族是治疗炎症和自身免疫性疾病的潜在靶标，SLAMF8 协同SLAMF9 正向调节Toll 样受体4，激活的TLR4 刺激丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB 信号转导，从而刺激炎性细胞因子的释放[14]。

综上所述，FIGNL1 介导的肺组织细胞DNA 受损、IRF7 和GBP5 介导的Ⅰ型IFN 应答、ARG1 介导的精氨酸代谢以及ICOS、CYSLTR1 和SLAMF8 介导的趋化因子和炎性因子的活化与甲型流感病毒所导致的肺损伤密切相关。 目前针对病毒引起的肺炎肺损伤仍然无特效药，只能对症治疗。 这些关键的基因能否成为病毒性所致的肺损伤的治疗靶点，仍需进一步探究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突