卢葵花，徐俊杰，胡 鑫

(1．湖北科技学院临床医学院，湖北 咸宁 437100；2．湖北科技学院五官医学院)

食管癌是我国最常见且严重影响人民健康水平的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于胃癌[1-2]。早期食管癌手术切除后5年生存率高，患者预后良好，而中晚期食管癌术后5年生存率低于10%，患者预后差[3-4]。迄今，食管癌的诊断方法仍以细胞学检查和内镜检查为主，但其灵敏度和特异性欠佳[5]。近年来国内外学者对有关食管癌早期诊断的分子生物学标志物作了大量的研究，如肿瘤标志物P53、COX、VEGF、Fascin等，但食管癌的发生机制尚不明确，众多标记物的敏感性、特异性还有待提高[6-9]。研究表明，上皮特异性ETS转录因子3(ESE3)在食管鳞状上皮和食管鳞状细胞癌中都有表达，ESE3蛋白在正常食管鳞状上皮定位于细胞核，在异型增生及癌变的食管上皮中出现异常胞质定位[10]。因此，血清ESE3有可能成为食管鳞状细胞癌早期诊断的血清学指标。本研究探讨ESE3蛋白检测在食管鳞状细胞癌早期诊断中的作用，旨在寻找食管鳞状细胞癌早期诊断特异性强、敏感性高的血清学标记物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集于湖北科技学院附属第一医院和湖北省肿瘤医院消化科和消化内镜中心就诊，且诊断为食管鳞状细胞病变的患者87例，均于病理科留存食管病变样本和血清标本，按病理诊断结果分为食管轻度异型增生12例、中度异型增生13例、重度异型增生15例、早期食管鳞状细胞癌26例(均为原位癌)、进展期食管鳞状细胞癌21例；患者年龄45～81岁；男61例，女26例。纳入标准：①经病理诊断为食管异型增生或食管鳞状细胞癌者；②入组前未接受放疗或化疗。排除标准：①病理诊断为食管腺癌患者；②有其他部位恶性肿瘤患者；③临床资料不完整者。同时选取10例正常鳞状上皮作为对照，同样留取对应的血清标本。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色

①切片：对所有标本进行4μm连续切片；②脱蜡水化：将切片依次放入二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中脱蜡，各15min，将脱蜡后的切片按顺序放入梯度酒精溶液中进行脱水，经脱蜡水化后，漂洗、加用血清封闭；③杂交：加一抗4℃冰箱孵育过夜，漂洗、甩干，滴加二抗室温孵育30min；④染色：洗去二抗，滴加DAB显色，清水冲洗，苏木精复染1min，流水冲洗5min，梯度酒精脱水，封片、阅片；⑤结果判读[11]：将ESE3蛋白定位于细胞质中呈棕色评定为阳性，随机选取5个高倍镜视野，其中细胞染色强度评分：无色记作0分，淡黄色记作1分，棕黄色记作2分，棕褐色记作3分；阳性细胞百分比评分：阴性记作0分，阳性细胞≤10%记作1分，阳性细胞11%～50%记作2分，阳性细胞51%～75%记作3分，阳性细胞>75%记作4分；最终染色评分结果为细胞染色强度评分与阳性细胞百分比评分乘积，对5个随机视野的评价结果取平均值作为最终ESE3蛋白阳性率的结果。

1.2.2 ELISA方法检测

ESE3 ELISA试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司，具有高效、灵敏、特异的抗体，具体检测步骤如下：①标准品稀释与加样：收集各样品血清，在酶标板上设置标准品孔，用标准品稀释液对样品进行稀释，将样品悬空加入酶标板底部，轻轻混匀；②温浴：用封板膜进行封板，37°C 30min；③洗涤：甩干，每孔加洗涤液200μL，静置30s弃液，重复5次，充分甩干液体；④加酶：每孔加入酶标试剂50μL；⑤温浴、洗涤：操作同上；⑥显色：每孔加入显色剂A液50μL，显色剂B液50μL，轻轻混匀，37°C避光显色15min；⑦终止、测定：每孔加入终止液50μL，测定各孔吸光度。

1.2.3 各级异型增生食管、早期食管鳞状细胞癌、进展期食管鳞状细胞癌分组方法

对各组食管黏膜组织进行碘染色内镜检查，由于异常鳞状上皮细胞中糖原含量减少或者消失，遇碘之后染色较浅或者不染色，故各级异型增生食管黏膜着色介于浅染与不染之间，表现为程度不同的淡染或者不染，轻度、中度和重度异型增生着色依次减弱；食管鳞状细胞癌中出现斑秃样、地图状不着色区域，边缘与染色深的背景分界清楚可辨，进展期食管鳞状细胞癌呈现多发或者主病灶延伸的不染色部位。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 ESE3蛋白在食管病变各阶段的免疫组化染色情况比较

免疫组化染色结果显示，正常鳞状上皮细胞质中几乎无ESE3蛋白阳性表达；ESE3蛋白在食管鳞状细胞癌各阶段均有阳性表达。ESE3在轻度异型增生中阳性表达率为16.67%(2/12)，少部分定位于细胞质；在中度异型增生中阳性表达率有所升高，为23.08%(3/13)，一部分定位于细胞质；而在重度异型增生中阳性表达率为33.33%(5/15)，绝大部分定位于细胞质；在早期食管鳞状细胞癌以及进展期食管鳞状细胞癌中几乎完全定位于细胞质，阳性表达率分别为53.85%(14/26)、61.90%(13/21)，异型增生各组阳性表达率差异无统计学意义(χ2=1.03，P>0.05)，但异型增生组织阳性表达率与食管鳞状细胞癌组织阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1(封二)。

2.2 食管鳞状细胞癌各阶段血清ESE3蛋白水平比较

ELISA结果显示，食管鳞状细胞癌各阶段血清ESE3蛋白水平为食管轻度异型增生<中度异型增生<重度异型增生<早期食管鳞状细胞癌<进展期食管鳞状细胞癌，差异比较有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 食管鳞状细胞癌各个发生发展阶段血清

2.3 血清ESE3蛋白水平与食管鳞状细胞癌不同阶段的Spearman相关性分析

Spearman相关分析结果显示，血清ESE3蛋白水平与食管鳞状细胞癌不同阶段呈显著正相关(r=0.307，P<0.05)。

2.4 血清ESE3对食管鳞状细胞癌的诊断价值

血清ESE3检测食管鳞状细胞癌的AUC为0.838(95%CI：0.750～0.926)，最佳截取值为552.15pg/mL，此值时敏感度为93.60%，特异度为70.00%，见图2。

图2 血清ESE3诊断食管鳞的ROC曲线

3 讨 论

食管鳞状细胞癌是一种具有高发病率和高死亡率的恶性肿瘤疾病，其早期诊断率低，食管鳞状细胞癌每年可致高达15万人死亡[12-13]。食管鳞状细胞癌的组织病理类型包括鳞状细胞癌和腺癌两种，在我国食管鳞状细胞癌约占全部食管癌90%以上[14]，由于早期缺乏特异性症状，多数食管鳞状细胞癌患者确诊时已处于肿瘤中晚期[15]。尽管近年来各种消化内镜技术不断发展，但患者5年生存率仍较低，给其家庭以及社会造成巨大经济压力[16]，而血清检查具有无创、简捷、费用相对较低等特点，因此，寻找能够早期诊断食管鳞状细胞癌的血清检测指标具有重要意义。

ETS是转录因子家族中最大的家族之一，上皮组织特异性表达的ETS基因又被简称为ESE基因，包括ESE1、ESE2和ESE3，主要表达于上皮组织和上皮来源细胞，参与调控细胞分化与增殖[17]。既往文献[18]研究表明，ESE3在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用，其在上皮组织中表达下调会影响上皮细胞正常分化过程。报道显示[19-22]，ESE3在前列腺癌、胰腺癌中缺失表达，并作为潜在的抑癌基因发挥作用，但其在卵巢癌以及胃癌中表达升高，可作为卵巢癌预后不良的诊断指标。Li等[10]发现ESE3的核定位可以通过其过表达来恢复，ESE3重新定位可能是食管鳞状上皮癌变的机制。本研究结果显示，正常鳞状上皮细胞质中几乎无ESE3蛋白阳性表达，ESE3蛋白在食管鳞状细胞癌各个发生发展阶段均有阳性表达，其在轻度异型增生、中度异型增生、重度异型增生组织中阳性表达率依次为16.67%、23.08%、33.33%，各种异型增生类型组织中阳性表达率差异无统计学意义，但定位于细胞核数量逐渐减少，定位于细胞质数量逐渐增多；在早期食管鳞状细胞癌以及进展期食管鳞状细胞癌中阳性表达率分别为53.85%、61.90%，几乎完全定位于细胞质，且食管鳞状细胞癌组织中阳性表达率显著高于异型增生组织中阳性表达率，差异有统计学意义(P<0.05)，表明ESE3可能参与了食管鳞状细胞癌进展过程。ESE3在正常鳞状上皮细胞核中表达，但定位于食管鳞状细胞癌细胞质中，其从细胞核到细胞质的转移可能与细胞核输出系统饱和以及变性蛋白质相互作用有关。同时，血清ESE3蛋白在食管轻度异型增生、中度异型增生、重度异型增生、早期食管鳞状细胞癌以及进展期食管鳞状细胞癌各个发生发展阶段的蛋白水平依次逐渐升高，表明ESE3蛋白在异型增生以及癌变的食管上皮中出现异常胞质定位，可能造成ESE3蛋白被外泌到胞外，导致血清中ESE3含量升高，其亚细胞的改变可能导致食管鳞状细胞癌转录调控发生改变，进而导致食管鳞状细胞癌发生。因此，ESE3蛋白的异常胞质定位可能是食管鳞状细胞癌癌变过程中的早期事件。

基因表达是一个多角度、多层次的调控过程，ESE3作为一个重要的转录因子，在前列腺癌、胰腺癌中起着抑癌基因的作用，并被启动子甲基化沉默，而在胃癌、乳腺癌以及结肠癌等中过度表达，并提示不良预后。本文研究结果还显示，Spearman相关分析表明，血清ESE3蛋白水平与食管鳞状细胞癌发生阶段呈显著正相关，表明血清ESE3蛋白水平越高，食管鳞状细胞癌的发生风险升高。故ESE3蛋白在食管鳞状细胞癌发生、发展过程中扮演着重要的角色，检测其表达有可能对评估食管鳞状细胞癌癌前病变的演变发挥重要作用。进一步ROC曲线分析结果显示，血清ESE3检测食管鳞状细胞癌的AUC为0.838，敏感度为93.60%，特异度为70.00%，表明ESE3对食管鳞状细胞癌有一定的诊断价值，其敏感性较高，但特异度稍差，作为诊断食管鳞状细胞癌的独立血清学指标可能还存在缺陷，但用于辅助诊断食管鳞状细胞癌具有重要的意义。报道表明[23]，ESE3通过抑制调控半胱天冬酶3(caspase3)及其活性参与细胞凋亡调控过程，从而促进细胞凋亡。ESE3在胃癌中可能通过激活受体络氨酸激酶家族分子EGFR/HER等分子促进细胞增殖、分化，进而抑制细胞凋亡[22]。ESE3在食管癌细胞系中过表达后，入核数量明显增多，进而削弱了其对食管癌细胞的增殖、侵袭能力[24]。亦有研究[25]显示，ESE1蛋白在正常食管黏膜、癌旁非典型增生以及食管鳞癌组织中阳性表达率依次升高，其异常表达与食管上皮癌变有关。但有关ESE3在食管鳞状细胞癌发生、发生过程中的分子作用机制研究较少，我们推测ESE3蛋白的重新定位可能在食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭中发挥作用，有可能是食管鳞状细胞癌变的新机制。但本文研究尚且存在不足之处，各组收集的病例数量过少，容易出现一定程度上的结果偏差，后续还要增加病例量，开展多中心研究以提供更多的支持依据。基于ESE3在不同肿瘤中发挥出来的作用不尽相同，且国内外类似报道极少，本研究得出的仅为初步研究结果。故本研究结论尚需建立基因敲除和过表达小鼠模型对其进一步进行功能研究，其对食管鳞状细胞癌靶基因的具体调控作用以及分子机制有待详细阐明。

综上所述，ESE3蛋白在食管鳞状细胞癌细胞质内的表达显著上调，并与食管鳞状细胞癌发生、发展有关，可为食管鳞状细胞癌早期诊断、预防以及治疗提供科学根据。