陈 俊，曹 阳，汪定奇，李娟娟，易梦凡，周 卫，吴晓琴

(武汉科技大学化学与化工学院，湖北 武汉，430081)

利用微生物发酵法生产有机酸，具有原料来源丰富、产品成本低廉、食用安全性高等优点[1]，而谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum，C.glutamicum)则是经典的食品安全级微生物，其培养条件简单、生长速度快，并且全基因组序列已知，遗传背景清晰，利于遗传改造[2-4]，经遗传改造的C.glutamicum可以高效用于生产琥珀酸[5]、丙酮酸[6]和L-苹果酸[7]等有机酸。C.glutamicum经糖酵解所产生的丙酮酸在有氧条件下经过TCA循环最终生成草酰乙酸，在此循环中，多种有机酸如琥珀酸、富马酸和苹果酸等被合成；而在厌氧条件下，丙酮酸将通过还原TCA或rTCA途径，经草酰乙酸直接转化成苹果酸、富马酸和琥珀酸，该途径是合成四碳二羧酸得率较高的途径，丙酮酸通过固定二氧化碳，使得理论上的糖酸转化率高达200%[8]，因此，无论从有机酸的产率、安全性还是立体选择性等方面考虑，C.glutamicum都是非常理想的有机酸生产菌株。不过，野生型C.glutamicum虽在代谢途径中生成多种有机酸，但并不积累这些有机酸，故本课题组构建了阻断乙酸和乳酸合成途径的C.glutamicumCZ04重组菌株[9]，在此基础上，本文采用同源重组的方法，通过引入超氧化物歧化酶基因启动子(Psod)以增强羧化途径的关键酶活性，进而强化C.glutamicum的羧化代谢途径，同时检测了相应有机酸的积累情况，以期为微生物发酵技术在实践中的应用提供参考。

1 试验

1.1 材料及重组菌株的构建

1.1.1 培养基

LB液体培养基中胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠的质量浓度分别为10、5、10 g/L，在此基础上按15 g/L添加琼脂粉制得LB固体培养基。……