李萌，粘婧，李德华

(1.锦州医科大学人体解剖学教研室，辽宁 锦州 121000；2.抚顺市中心医院，辽宁 抚顺 113000)

间充质-上皮转化因子(mesenchymal-epitransition factor，MET)是一种由MET原癌基因编码的蛋白，MET的异常活化可触发血管生成、肿瘤生长和转移[1-3]。Maulik等人[4]报道了在SCLC中c-MET/HGF通路的功能，并认为该通路可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。热休克蛋白70C末端反应蛋白(CHIP)是一种u-box型E3泛素连接酶，其底物包括糖皮质激素受体、c-Raf激酶、ErbB等致癌蛋白。CHIP可以诱导其底物发生泛素化以及发生蛋白酶体降解[5]。人们发现CHIP表达上调可以抑制肿瘤的生长和转移，在人乳腺癌和胃癌中CHIP表达水平与肿瘤恶性程度呈负相关[6]。然而，CHIP对抑制SCLC的确切作用机制尚不十分清楚。在本研究中，我们拟通过在SCLC细胞株中转染构建CHIP表达载体，探讨其是否发挥肿瘤抑制作用。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

SCLC细胞株(NCI-H69，NCI-H82，NCI-H209，NCI-H345，NCI-H526)购自上海细胞库。MG132购置于sigma公司。DNA提纯试剂盒和DNA 扩增试剂盒购置于北京天恩泽生物公司；兔抗MET、CHIP、paxillin、pAkt、ERK、FAK抗体及CCK-8试剂盒购于北京博奥森生物技术公司；pcDNA3载体、 pAcGFP1-N1载体、myc-His A载体、Taq DNA 聚合酶购于大连宝生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 瞬时转染

细胞按照 1×105个/孔接种到 6孔培养板中，加入完全培养基，二氧化碳培养箱中 37 ℃过夜。2 μg 的待转染的质粒(阴性对照载体CHIP(-)、CHIP表达载体CHIP(+)、对照载体pGFP：-和CHIP表达载体(pGFP-CHIP：+)。同时用 100 μL 的无血清培养基稀释 5 μL 的Lipofectamine Plus转染试剂，将以上2种溶液混匀，室温下放置 30 min 左右。细胞培养至 80%融合时加入 1 mL 的无血清培养基，并将上述混合好的溶液逐滴加入到每孔中，轻摇混匀，二氧化碳培养箱中 37 ℃培养 24 h。……