张冠磊，马苗苗，兰文静，王琳

0 引言

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌类型的80%以上，具有发病率高、病死率高的特点，近年来发病率有逐渐升高的趋势[1]。NSCLC病情隐匿，早期极易误诊或漏诊，贻误病情，使患者失去最佳手术时机，预后生存期短[2]。因此，了解NSCLC发生发展机制，寻找有效干预手段，对患者治疗至关重要。近年来研究表明，NSCLC与多基因、多环节异常改变有关，其中长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）表达调控与其改变关系紧密，参与肿瘤发生及发展的多个环节[3-4]。研究发现，LncRNA-p21具有抑制胃癌、肺癌等癌细胞侵袭、转移的作用，但具体调控机制尚不清楚[5-6]。本研究通过脂质体转染过表达LncRNA-p21质粒载体，上调A549细胞中LncRNA-p21基因表达，观察过表达LncRNA-p21基因对A549细胞增殖和侵袭等能力的影响及作用机制，为临床NSCLC靶向治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

非小细胞肺癌A549细胞系购自上海生科院细胞库；pcDNA-lincRNA-p21、空载质粒pcDNA（上海吉玛公司）；Notch信号通路特异性激活剂Jagged1蛋白（美国R&D Systems公司）；LipofectamineTM2000试剂盒、TRIzol（美国Invitrogen公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）试剂盒（美国Sigma-Aldrich公司）；细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；一步法实时荧光定量PCR试剂盒（美国QIAGEN公司）；二喹啉甲酸蛋白定量分析试剂盒（美国Thermo公司）；兔抗人Notch1、转录因子HES-1、Notch1胞内结构域（Notch 1 intracellular domain,NICD）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）单抗（一抗）、HRP标记二抗（美国Santa Cruz公司）；StepOnePlus Real-Time PCR仪（美国Thermo Fisher公司）；ELx800TS酶标仪（美国BioTek公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 非小细胞肺癌A549细胞置于含10%FBS的DMEM培养基，于5%CO2、37℃恒温箱培养，每两天换液一次，3～5天传代1次。

1.2.2 细胞转染及分组 取对数期细胞常规消化并接种至6孔板，细胞再次贴壁至70%左右时，更换无血清培养基同条件孵育12 h，严格按照LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒操作，继续培养6 h，更换无双抗培养基，继续培养32 h，获得稳定转染细胞设为过表达组，同法获得转染空载质粒pcDNA A549细胞，获得稳定转染细胞设为空载组，同时取未经处理的A549细胞株为对照组。取稳定转染过表达组细胞，加入Jagged1蛋白（终浓度5 mg/L），设为Notch激活剂组。

1.2.3 转染后LncRNA-p21基因表达检测 取稳定转染的各组细胞，胰蛋白酶消化后，离心收集各组细胞，RT-qPCR法检测各组LncRNA-p21基因表达情况。TRIzol法提取总RNA，反转录获取cDNA；根据SYBR Green PCR试剂盒设定反应体系：SYBR Green PCR buffer 5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.2 μl，dNTP酶10.0 μl，ddH2O 4.6 μl；反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性20 s，59℃退火40 s，72℃延伸30 s，重复42个循环。以内参β-actin作对照物，按照2-ΔΔCT计算LncRNA-p21相对表达强度，引物序列见表1。

1.2.4 MTT法检测各组细胞增殖能力 取稳定转染空载组、过表达组、空白组及Notch激活剂组细胞，调整细胞密度，以每毫升1×105个接种于96孔板，每组5个复孔。培养至24、48及72 h时，加入20 μl浓度为5 mg/ml MTT溶液，继续孵育4 h，倾倒上层培养液，各孔加入DMSO溶液150 μl，混匀后，酶标仪测定570 nm波长处吸光度（A）值。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 取稳定转染空载组、过表达组、空白组及Notch激活剂组细胞，以每毫升5×104个重新接种于6孔板，每组5个复孔；同条件下继续培养，待细胞再次融合完整后，用50 μl无菌枪头于培养板中间划直线，移液管吸取细胞培养液轻轻吹洗，确认划痕边缘整齐，加入完全培养基，48 h后于倒置显微镜下观察并拍照。细胞迁移率（%）=（初始划痕宽度-48 h划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.2.6 Transwell法检测细胞侵袭能力 收集各组细胞，Transwell小室滤膜由1:6稀释的DMEM人工基质均匀涂布，37℃恒温培养箱放置40 min左右胶干；下层小室加入培养12 h后的无细胞上清液，上层小室加入培养12 h的单细胞悬液。继续孵育48 h后，用手术镊取下中间滤膜，置于质量分数3.7%甲醇固定，经结晶紫染色后，于显微镜下随机取5个视野，计数并统计平均穿膜细胞数。

1.2.7 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin基因表达检测 取稳定转染空载组、过表达组、空白组及Notch激活剂组细胞，调整细胞密度，以每毫升1×105个接种于96孔板，培养48 h。胰蛋白酶消化后，离心收集各组细胞，RT-qPCR法检测各组细胞中Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、Vimentin基因表达情况。TRIzol法提取总RNA，反转录法获得cDNA；严格按照SYBR Green PCR试剂盒进行试验。以2-ΔΔCT计算目的基因的相对表达强度。各基因上下游引物序列见表1。

1.2.8 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、和Vimentin蛋白表达检测 取稳定转染空载组、过表达组、空白组及Notch激活剂组细胞，调整细胞密度以1×105个/毫升接种于96孔板，培养48 h。胰蛋白酶消化后，离心收集各组细胞，加入0.5 ml细胞裂解液，于冰上裂解20 min，12 000 r/min离心10 min取上清液，BCA试剂盒测定蛋白总量。取50 μg样品进样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后电转、封闭，按要求加入稀释一抗4℃摇床孵育过夜，TBST洗涤3次×5 min后，加入稀释二抗，室温孵育2 h，TBST洗涤3次×5 min，于暗室中显影、定影，扫描拍照后采用Image J软件分析各条带灰度值，蛋白相对表达量用Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、Vimentin蛋白与内参β-actin灰度值比值表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件，计量资料均以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两样本间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中LncRNA-p21基因表达比较

过表达组、空载组及对照组LncRNA-p21基因相对表达量分别为8.57±1.36、1.07±0.15、1.02±0.14，组间比较差异有统计学意义（F=146.674,P<0.001）；过表达组LncRNA-p21基因相对表达量高于空载组和对照组（t=12.257、12.348,均P<0.001）；空载组与对照组比较，差异无统计学意义（t=0.545,P=0.601），见图1。

2.2 各组细胞增殖情况比较

不同时间四组间MTT实验A值比较，差异有统计学意义（P<0.05）；过表达组培养24、48、72 h MTT实验A值均低于对照组、空载组和Notch激活剂组，Notch激活剂组低于对照组和空载组，差异均有统计学意义（P<0.05）；对照组与空载组培养24、48、72 h MTT实验A值比较，差异无统计学意义（P>0.05）；四组培养48 h MTT实验A值均高于培养24 h（P<0.05），且培养72 h MTT实验A值高于48 h（P<0.05），见表2。

图1 各组细胞中LncRNA-p21基因表达比较Figure l Comparison of LncRNA-p21 gene expression in each group

2.3 各组细胞迁移情况比较

对照组、空载组、过表达组和Notch激活剂组48 h细胞迁移率分别为（71.69±6.20）%、（71.50±6.53）%、（49.32±5.20）%、（63.17±5.92）%，四组间比较差异有统计学意义（F=1 5.5 4 4,P<0.001）；过表达组48 h细胞迁移率低于空载组、对照组和Notch激活剂组（t=6.182、5.941、3.647,均P<0.05），Notch激活剂组低于对照组和空载组（t=2.483、2.367,均P<0.05）；空载组与对照组间差异无统计学意义（t=0.047,P=0.964），见图2。

2.4 各组细胞侵袭情况比较

对照组、空载组、过表达组和Notch激活剂组48 h穿膜细胞数分别为173.33±22.00个、179.00±19.33个、62.33±10.33个、107.00±9.33个，四组间比较差异有统计学意义（F=59.514,P<0.001）；过表达组48 h穿膜细胞数少于空载组、对照组和Notch激活剂组（t=10.212、11.903、7.176,均P<0.001），Notch激活剂组少于对照组和空载组（t=6.207、7.501,均P<0.001）；空载组与对照组间差异无统计学意义（t=0.433,P=0.677），见图3。

表1 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、Vimentin基因引物序列Table 1 Primer sequences of Notch1,HES-1,NICD,E-cadherin and Vimentin genes

表2 各组细胞不同时间MTT试验A值比较Table 2 Comparison of A value of MTT test at different time among each group

2.5 各组Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin的mRNA表达比较

Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin mRNA相对表达量在四组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；过表达组Notch1、HES-1、NICD、Vimentin mRNA相对表达量低于空载组、对照组和Notch激活剂组，Notch激活剂组低于对照组和空载组，差异均有统计学意义（P<0.05）；过表达组中E-cadherin mRNA相对表达量高于空载组、对照组和Notch激活剂组，Notch激活剂组高于对照组和空载组，差异均有统计学意义（P<0.05）；空载组与对照组间差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。

2.6 各组Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin蛋白表达比较

Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；过表达组Notch1、HES-1、NICD、Vimentin蛋白相对表达量低于空载组、对照组和Notch激活剂组，Notch激活剂组低于空载组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；过表达组中E-cadherin蛋白相对表达量高于空载组、对照组和Notch激活剂组，Notch激活剂组高于空载组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；空载组与对照组间差异均无统计学意义（P>0.05），见表4、图4。

图2 各组划痕实验48 h细胞迁移率结果Figure 2 Cell migration rates of each group at 48 hours detected by scratch test

图3 Transwell实验48 h穿膜细胞数结果Figure 3 Number of transmembrane cells at 48 hours detected by Transwell test

表3 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin mRNA相对表达量比较Table 3 Comparison of relative expressions of Notch1,HES-1,NICD,E-cadherin and Vimentin mRNA

图4 各组蛋白免疫印迹图Figure 4 Immunoblotting diagrams of proteins in each group

3 讨论

近年来，尽管手术及其他综合治疗手段不断进步，NSCLC治疗成功率有所提高，但仍有部分患者预后不佳，寻找新的治疗靶点意义重大。近年来研究表明，LncRNA可通过调控微小RNA或下游编码区RNA参与肿瘤的发生、发展，目前已成为肿瘤发生、发展机制相关研究的热点[7]。LncRNA-p21在多种恶性肿瘤组织或细胞中异常表达，且与肿瘤增殖、侵袭及迁移相关[8-9]。Notch信号通路是存在于多种动物体内的信号交点通路，在上皮间质转化（EMT）、细胞增殖、迁移及分化等多种肿瘤生物学活动中发挥重要调控作用[10-11]。因此，探讨LncRNA-p21能否通过调控Notch信号通路对NSCLC细胞的EMT过程产生影响，从而影响癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力有重要意义。

本研究采用脂质体转染法上调A549细胞中LncRNA-p21基因的表达，结果显示过表达组LncRNA-p21基因相对表达量高于空载组和对照组，说明成功上调该基因的表达。基因组测序分析显示，人类基因组非编码区存在大量LncRNA，其中约2.4万个LncRNA参与转录、干扰、染色质修饰等多项生物学活动[12]。Han等[13]研究发现，LncRNA-p21在恶性骨肉瘤组织中表达受到抑制，体外试验表明，上调LncRNA-p21表达可抑制骨肉瘤细胞增殖，与本结果一致。Isin等[14]发现LncRNA-p21在前列腺癌患者中异常低表达，可作为鉴别诊断前列腺癌和良性前列腺增生的可靠标志物。本研究结果提示LncRNA-p21基因过表达可抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭能力。

表4 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量比较Table 4 Comparison of relative expressions of Notch1,HES-1,NICD,E-cadherin and Vimentin protein

本研究结果显示，Notch激活剂组A549细胞增殖、迁移及侵袭能力较过表达组增强，Notch1信号通路相关基因和蛋白表达较过表达组均有上调，过表达组Notch1信号通路相关基因和蛋白表达较对照组和空载组均下调，提示过表达LncRNA-p21基因对非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭能力的抑制作用可能与抑制Notch信号通路、阻断A549细胞上皮间质转化过程有关。人类Notch信号通路主要由Notch受体（1-4）、Notch配体（DSL蛋白）及相关靶基因HES-1、同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白等组成[15]。Notch1信号通路在多种恶性肿瘤组织中检测出激活状态，参与肿瘤化疗耐药、侵袭及转移过程[16-17]。Notch1信号通路中受体与配体结合后激活，受体蛋白水解，继而释放出NICD易位于细胞核，与核内多种转录因子结合调控下游靶基因转录和表达。HES-1是Notch1信号通路下游靶基因，有抑制细胞增殖作用[18-19]。E-cadherin及Vimentin分别是上皮及间质标记基因，两者在维持细胞形态、结构完整、细胞间黏附作用等方面起重要作用[20]。研究显示，活化Notch1片段NICD可诱导转录性抑制体大量表达，继而与E-cadherin结合，增加细胞间接触抑制从而抑制EMT，抑制细胞侵袭及迁移能力[21]。

综上，本研究得出LncRNA-p21基因过表达可抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭，其调控机制可能与抑制Notch信号通路，从而阻断A549细胞上皮间质转化过程有关，为临床通过靶向干扰LncRNA-p21基因表达治疗NSCLC提供理论支持。