曹世哲，罗 昌，陈东亮，刘 华，程 曦，黄丛林*

(1 北京农学院 园林学院，北京 102206；2 北京市农林科学院 北京农业生物技术研究中心，北京 100097；3 北京市功能花卉工程技术研究中心，北京 100097)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat)为菊科菊属宿根草本花卉，不仅是重要的观赏植物，而且是非常重要的食用、茶用和药用植物。目前已有大量文献报道了菊花中含有多种药理和生物活性成分。其中，黄酮类化合物(flavonoids)是最重要的活性成分。黄酮类化合物别名类黄酮，是植物中一类对人类健康有重要价值的次生代谢产物，具有多种生物活性和药用功效，如抗炎、抗氧化、抗癌、降血压、降血糖、保护神经和调节机体免疫力等[1]。此外，黄酮类化合物还在植物自身生理生化过程中发挥重要作用，如对植物的生长发育起到控制调节作用，保护植物组织免受紫外线伤害、花的着色和种间相互作用的信号传导，还能抵抗外界非生物胁迫以及昆虫侵袭等[2-3]。目前已知的黄酮类化合物超过1万种[4]，根据其基本分子结构的杂氧环和构象的不同，一般可划分为黄烷酮(falvanone)、黄酮(flavones)、异黄酮(isoflavones)、黄酮醇(flavonols)、黄烷醇(flavanols)和花色素(anthoyanidins)六大类[5]。黄酮类化合物是由一系列酶催化而合成的2-苯基色原酮衍生物。

黄烷酮3-羟化酶(Flavanone 3-hydroxylase，F3H)属于2-O-酮戊二酸和铁离子依赖的双加氧酶超家族(2-ODD)，是黄酮类化合物合成途径分支点的一个核心酶，可将黄烷酮类底物还原为二氢黄酮醇类化合物，而二氢黄酮醇类化合物是合成黄酮醇和无色花色素类物质的前体物质[6-7]，从而F3H可间接调控黄酮醇、黄烷醇和花青素等黄酮类物质的合成，最终影响植物中黄酮类物质含量和植物花色[8]。第一次关于F3H活性的研究是在紫罗兰(Matthiolaincana)中报道的，但因为酶活性低、不稳定，从紫罗兰中纯化该酶并没有成功。F3H的第一次成功纯化及鉴定是Britsch等[9]在矮牵牛(Petuniahybrida)的红花突变体中进行的。

F3H基因最早由Martin等[10]从金鱼草(AntirrhinummajusL)中分离得到，此后，研究人员陆续从银杏(Ginkgobiloba)、玉米(Zeamays)、茶树(Camelliasinensis)等植物中克隆并鉴定了F3H基因。目前关于F3H基因的深入研究，大部分集中在其色素生物合成功能方面。F3H基因在花青素合成过程中发挥着重要作用，Wisman等[11]在拟南芥中阻断F3H基因的表达，导致拟南芥植株体内黄酮及花色素等含量变低；Jiang等[12]利用RNA干扰技术使草莓(Fragaria×ananassaDuch)中F3H基因沉默，液质联用分析结果显示草莓果实中花青素含量显著降低。由此可见，F3H基因在植物花色素等黄酮类化合物合成途径中具有重要作用。目前，关于茶用菊花中F3H基因及其启动子序列的信息较少。

本试验以作者团队自育的茶菊(Chrysanthemummorifolium)品种‘14-C-1’为试验材料，克隆并分析了CmF3H基团及其启动子序列，利用荧光定量PCR分析了CmF3H基因在‘14-C-1’不同组织部位的表达水平，以期为深入研究CmF3H基因功能，提高茶菊黄酮类化合物含量，改良茶菊品质提供一定分子基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

本试验所用材料为北京农业生物技术研究中心自育的茶菊(Chrysanthemummorifolium)品种‘14-C-1’，种植于25 ℃的玻璃温室中。

1.2 方 法

1.2.1CmF3H基因的克隆取茶菊‘14-C-1’顶端叶片2～3片，利用RNA提取试剂盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit, TaKaRa公司)，提取总RNA，再用PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)将所提取RNA反转录为cDNA并检测其浓度。根据F3H的保守序列，在转录组数据库中通过Blast比对得到CmF3H基因相关的序列信息。利用Primer 6.0软件设计特异引物CmF3H-F/R (表1)，进行PCR 扩增，反应程序为94 ℃变性 10 s，55 ℃ 退火15 s；72 ℃ 延伸1 min；32个循环。琼脂糖凝胶电泳，切取特异片段，回收纯化目的片段后连接到pGEM-T Easy载体上，转化、测序，获得CmF3H的ORF全长序列。

1.2.2CmF3H基因生物信息学和系统发育分析利用NCBI Conserve Domain Database分析CmF3H蛋白的保守结构域，利用ExPaSy(https://web.expasy.org/protparam/)在线预测CmF3H蛋白的分子量、等电点、不稳定系数、脂肪指数及疏水性等理化性质；下载其他物种F3H基因编码氨基酸序列，利用DNAMAN软件进行多重序列比对；运用MEGA7.0构建系统发育树。

1.2.3CmF3H基因启动子的克隆和元件功能分析取茶菊‘14-C-1’叶片，采用CTAB方法提取DNA，采用染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit，TaKaRa公司)克隆CmF3H启动子，根据CmF3H序列设计特异引物，SP1、SP2和SP3(表1)，三轮PCR模板依次为菊花基因组DNA、第一轮PCR产物和第二轮PCR产物，反应体系：10×PCR 缓冲液2.5 μL；Mg2+1.5 μL；dNTP(2.5mmol/L) 4.0 μL；AP(50 μmol/L) 1.0 μL；SP(10 μmol/L) 1.0 μL；DNA 1.0 μL；LA Taq 0.25 μL；ddH2O补充到25 μL，反应程序见试剂盒说明书。琼脂糖凝胶电泳，切取特异片段，回收纯化片段。将片段连接到pGEM-T Easy载体中，转化、测序。采用数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)分析预测顺式作用元件[13]。

表1 引物序列

1.2.4CmF3H基因在‘14-C-1’不同组织部位中的表达分析利用RNA提取试剂盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取茶菊‘14-C-1’不同组织部位根、茎、叶、花蕾、舌状花和筒状花的RNA，消除基因组DNA，用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit，TaKaRa公司)将所提取RNA反转录为cDNA并检测其浓度。利用Primer 6.0软件设计CmF3H特异性引物，qCmF3H-F/R，以UBIQUITIN基因为内参[14](表1)，参照实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq TM，TaKaRa公司)说明书进行操作，反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus，2×) 10 μL；cDNA 1.0 μL；qCmF3H-F 1.0 μL；qCmF3H-R 1.0 μL；ddH2O补充到20 μL，反应程序：95 ℃ 预变性30 s，95 ℃ 变性3 s，60 ℃ 复性30 s，40个循环，扩增仪器为Applied Biosystems StepOnePlusTMReal-Time PCR仪，设置3个生物学重复，采用2-ΔΔCT法计算相对表达量[15]。

1.2.5 数据分析试验数据用SPSS 17.0软件进行统计分析，并进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 菊花CmF3H基因的克隆及其结构域分析

以‘14-C-1’cDNA为模板，克隆得到约1 200 bp条带(图1)。测序结果表明CmF3H基因全长1 284 bp，开放阅读框1 095 bp，编码364个氨基酸。Blast蛋白序列比对发现，‘14-C-1’CmF3H与菊花栽培种‘SU07’的氨基酸序列相似性最高，为99.16%。

M. DL2000；1. CmF3H图1 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因克隆电泳检测Fig.1 Analysis of CmF3H gene from Chrysanthemum morifolium ‘14-C-1’

红色方框表示2-O-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)依赖性双加氧酶结构域；‘14-C-1’CmF3H. 茶菊‘14-C-1’；‘SU07’CmF3H. 菊花‘SU07’；RrF3H. 玫瑰；CsF3H. 茶树；MaF3H. 桑树；GhF3H. 棉花；PnF3H. 三七；CaF3H. 喜树；VcF3H. 蓝莓；CtF3H. 红花；CcF3H. 矢车菊；DpF3H. 大丽花图2 ‘14-C-1’CmF3H与其他物种同源蛋白F3H氨基酸序列比对Red frame. Functional region of 2-oxoglutarate (2OG) and Fe (Ⅱ) -dependent oxygenase；‘14-C-1’ CmF3H. Chrysanthemum morifolium ‘14-C-1’; ‘SU07’ CmF3H. Chrysanthemum morifolium ‘SU07’; RrF3H. Rosa rugosa; CsF3H. Camellia sinensis; MaF3H. Morus alba; GhF3H. Gossypium hirsutum; PnF3H. Panax notoginseng; CaF3H. Camptotheca acuminata; VcF3H. Vaccinium corymbosum; CtF3H. Carthamus tinctorius; CcF3H. Centaurea cyanus; DpF3H. Dahlia pinnataFig.2 Alignment of amino-acid sequences between ‘14-C-1’ CmF3H and F3H homologues from other species

与玫瑰、茶树、桑树、棉花、三七、喜树、蓝莓、红花和大丽花等物种的F3H氨基酸序列相似性分别为81.88%、81.19%、79.46%、79.76%、83.39%、80.24%、83.75%、80.90%和82.97%。氨基酸序列多重比对(图2)发现，CmF3H蛋白序列含有2-O-酮戊二酸和Fe2+-依赖的双加氧酶家族的保守结构域(从第200个氨基酸到第300个氨基酸)，推断它在菊花黄酮类化合物合成过程中发挥着与其他物种F3H蛋白相同或相似的功能。

2.2 CmF3H基因生物信息学和系统发育分析

蛋白序列结构分析表明，CmF3H分子量为41.19 kD，等电点为5.57，不稳定系数为39.51，平均亲水性为-0.465，脂肪指数为83.02，表明该蛋白为稳定、疏水性蛋白。用亚细胞定位预测与分析网站对CmF3H进行定位预测，结果显示，细胞质60.9%，细胞核26.1%，线粒体4.3%，液泡4.3%，分泌系统的小泡4.3%。由此得出，CmF3H主要定位在细胞质内。

图3 茶菊‘14-C-1’与其他物种F3H的进化树分析Fig.3 F3H phylogenetic tree analysis of C. morifolium ‘14-C-1’ and other species

M.DL2000；1、3、5、7. 二轮PCR产物，引物分别为AP1+SP2、AP2+SP2、AP3+SP2和AP4+SP2；2、4、6、8. 三轮PCR产物，引物分别为AP1+SP3、AP2+SP3、AP3+SP3和AP4+SP3图4 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因启动子克隆电泳检测M. DL2000; 1, 3, 5, 7. The second round of PCR products, primer is AP1+SP2, AP2+SP2, AP3+SP2 and AP4+SP2; 2, 4, 6, 8. The third round of PCR products, primer is AP1+SP3, AP2+SP3, AP3+SP3 and AP4+SP3Fig.4 Analysis of CmF3H gene promotor from C. morifolium ‘14-C-1’

系统进化树分析(图3)表明，茶菊‘14-C-1’与菊花栽培种‘SU07’亲缘关系最近。其次为菊科植物大丽花、矢车菊，与玫瑰、三七、茶树等亲缘关系较远。

2.3 CmF3H基因启动子序列的克隆与分析

克隆获得‘14-C-1’CmF3HORF上游长1 217 bp(图4)。启动子序列分析(表2)显示CmF3H基因启动子除包含真核生物核心启动子元件TATA-box、AT～TATA-box和CAAT-box外，还含有MYB识别位点MYBCORE、MYBCOREATCYCB1和MYB2CONSENSUSAT，以及调控功能元件：光响应元件BOX4和IBOXCORE、光响应与组织特异性表达元件G-box和GATA-box、ABA响应元件MYB1AT、干旱和ABA响应元件MYC、热诱导元件CCAAT-box、种子发育调控元件ACGTC-box等，这些元件表明该启动子很可能受光、ABA、干旱等外界环境因素的调控。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图5 茶菊‘14-C-1’不同组织部位CmF3H基因相对表达量Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05)Fig.5 Relative expression of CmF3H gene among different tissues of C. morifolium ‘14-C-1’

2.4 CmF3H基因在‘14-C-1’不同组织部位中的相对表达量

荧光定量PCR分析结果(图5)显示，CmF3H在‘14-C-1’筒状花中表达量最高，其次为茎、花蕾、叶、舌状花，在根中的表达量最低。其中筒状花的表达量与根、茎、叶等组织部位的表达量均存在显著性差异。

3 讨 论

目前，人们对植物中次生代谢产物的研究主要集中在黄酮类化合物、萜类化合物和生物碱等物质。其中黄酮类化合物是多种药用植物有效成分之一。黄酮类化合物合成途径的关键酶为F3H[16]。通过开展F3H基因及其启动子的克隆与功能分析，为提高植物中黄酮类化合物的含量提供理论支持，有助于药食两用植物的品质改良。

本试验从茶菊品种‘14-C-1’中克隆得到黄酮类化合物合成相关基因CmF3H。氨基酸序列分析表明，CmF3H编码氨基酸与其他物种F3H编码氨基酸序列有较高相似性，且具有2-O-酮戊二酸和Fe2+-依赖的双加氧酶家族的保守结构域，属于2-酮戊二酸依赖双加氧酶蛋白家族。系统进化分析显示，CmF3H蛋白序列与菊科植物如‘SU07’、大丽花、矢车菊、红花等聚为一类，说明F3H基因序列在菊科中的保守性相对较高，在基因进化方面不属于活跃类型，在基因表达的过程中，一般不会出现个别碱基的缺失或突变，从而保证在植物黄酮类化合物合成过程中正常表达发挥作用。单拷贝基因能被更好的调节控制，F3H基因在大多数植物中以单拷贝形式存在，如玉米、矮牵牛、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、山葡萄(Vitisamurensis)等，但也存在多拷贝形式，如葡萄(Vitisvinifera)中有2个拷贝[17-18]，紫苏(Perillafrutescens)中有2～3个拷贝[19]，小麦(Triticumaestivum)中存在4个拷贝[20]。

表2 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因启动子元件分析

研究表明，F3H基因在植物不同组织和不同发育时期的表达量不同。Kumar等[21]对余甘子(Phyllanthusemblica)中F3H基因在不同组织部位及不同时期的表达进行分析，发现PeF3H基因在花朵中的表达量较叶片和果实高，在果实成熟的过程中该基因表达量逐渐升高。毛玉珊[22]对柠条(Caraganakorshinskii)F3H基因组织特异性进行分析，发现CkF3H基因在柠条根、茎、叶中均有不同量的表达。本试验通过qRT-PCR对茶菊‘14-C-1’不同组织部位CmF3H基因相对表达量表明，CmF3H基因在根、茎、叶、花蕾、舌状花和筒状花中均有不同量的表达，表明该基因在茶菊‘14-C-1’中存在组织特异性；在筒状花中表达量最高，且显著高于其他组织部位的表达量，推测筒状花中所积累的黄酮类化合物如花色素类、黄酮醇类、黄烷醇类等物质高于其他组织部位，为以后茶用菊花育种和品质改良提供参考。

F3H基因功能的研究表明，F3H基因的表达受UV-B、盐、干旱、光照等多种因素的调控，在模式植物烟草中过表达F3H基因可提高转基因植株中黄酮类化合物的含量及其抗逆能力。Liu等[23]研究发现在UV-B辐射和干旱胁迫下，沙漠植物红砂(Reaumuriasoongorica)RsF3H酶活性增加，黄酮类化合物合成途径中产物积累，qRT-PCR分析表明，RsF3H基因的表达迅速增加；Mahaja等[24]研究发现盐胁迫下茶和转基因烟草(Nicotianatabacum)中F3H基因的表达量及酶活性都显著上升，黄烷-3-醇含量增加，对盐胁迫的耐受性明显增强；Song等[25]克隆枸杞(Lyciumchinense)的F3H基因并在烟草中过表达，试验结果表明，转基因烟草植株黄烷-3-醇的含量升高，抗氧化能力增强，对干旱胁迫的抵抗力增强。此外，F3H基因还能够在植物受到生物胁迫时发挥作用，Gutiérrez-Albanchez等[26]用芽孢杆菌QV15诱导黑莓(Rubuscv. Loch Ness)，试验结果表明RuF3H基因可改善植物在受到生物胁迫的适应性，提高果实品质。

不同的环境因素影响植物的生长发育，植物可以通过启动子中的顺式元件与转录因子相互协调，对胁迫产生应答。本研究中，CmF3H基因启动子序列存在多个与光照、温度、UV-B、ABA等相关的元件，以及MYB识别位点等。MYB转录因子普遍存在于植物中，广泛参与植物的生长发育和代谢调控，在非生物胁迫(如干旱、低温、高盐以及紫外辐射等)条件下，该转录因子的表达会发生特异性变化，增强植物适应复杂多变环境的能力。有研究表明MYB识别位点MYBCORE能调控牵牛花花瓣上表皮黄酮类化合物的生物合成[27]。茶菊品种‘14-C-1’CmF3H基因是否能够响应不同胁迫及ABA处理，进而影响黄酮类化合物成分的合成，还需进一步研究。

本试验成功从茶菊‘14-C-1’中克隆了CmF3H基因及其启动子，在后续的研究中将通过构建过表达载体进行转基因试验，并分析转基因植株中黄酮类化合物成分和含量，探究CmF3H的生物学功能。为后续茶菊分子育种提供有效基因元件，为获得高含量黄酮的茶菊品种奠定坚实的基础。