戢得蓉 刘松奇 熊坤艳 李 梦 胡明虎

(1. 四川旅游学院食品学院，四川 成都 610100；2. 湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

雪莲果(Saussureainvolucrata)，菊薯的别称，为菊科向日葵属双子叶草本植物[1]，其叶为对生，宽心脏形，表面粗皱，稍厚，一般在采摘雪莲果后废弃处理。研究发现，雪莲果叶中含多糖、黄酮、酚酸等多种活性成分[2]，其提取物具有抑菌[3]、抗氧化[4]及降血糖[5]等作用，其中黄酮类物质与降血糖功能有明显关系。黄酮类物质的提取和抗氧化能力是目前的研究热点[6-7]，常见的提取方法有溶剂提取法、超临界流体萃取法、酶法、超声波辅助法等[6,8]，超声波辅助酶法集合了超声波提取法和酶法两种提取方法的优点[9-10]，超声波振动可以破坏细胞壁使得细胞壁软化，引起细胞内物质的移动[11]，同时酶的加入使得总黄酮的提取具有高效性，两者结合可以得到高效稳定的产物[12-13]。陈红慧等[14-15]利用溶剂提取法对雪莲果叶中的总黄酮物质进行了提取和纯化研究，总黄酮提取率为53.41 mg/mL。目前未见其他关于雪莲果叶总黄酮物质提取方法的相关报道。

黄酮类物质为天然抗氧化剂，其结构中的酚羟基可与自由基结合，终止氧化反应，以此发挥抗氧化作用，其抗氧化能力与自身结构有一定关系[16]。植物中的黄酮类物质可从叶、茎及根中提取，不同来源、不同部位的黄酮类物质的组成及所具有的抗氧化能力不同[17]。对于总黄酮或者黄酮粗提取物的潜在的抗氧化能力的常见手段有测定2,2-联苯基-1-苦基肼基自由基(DPPH·)清除率、总还原力、羟基自由基清除率等[18-20]。对雪莲果叶总黄酮提取物的抗氧化能力的研究目前未见报道。

试验拟以雪莲果叶为原料，利用超声波辅助纤维素酶提取雪莲果叶中总黄酮，优化提取工艺条件，并探讨总黄酮提取物对DPPH·清除能力和总还原力，以期为雪莲果叶的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

雪莲果叶：采摘于成都市龙泉驿区；

芦丁标准品、维生素C标准品：成都金山化学试剂；

亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、盐酸、三氯化铁、三氯乙酸、铁氰化钾、四硼酸钠、混合磷酸盐、邻苯二甲酸氢钾、2,2-联苯基-1-苦基肼基：分析纯，成都市科龙试剂有限公司；

纤维素酶、果胶酶：2×104U/g，河南庆飞食品配料有限公司；

木瓜蛋白酶：1×105U/g，河南庆飞食品配料有限公司；

酸性蛋白酶：8×105U/g，河南庆飞食品配料有限公司；

碱性蛋白酶：2×105U/g，河南庆飞食品配料有限公司；

中性蛋白酶：5×104U/g，河南庆飞食品配料有限公司。

1.1.2 主要仪器

电热鼓风干燥箱：101-0型，北京中兴伟业仪器有限公司；

高速连续式超微粉碎机：YJ2-2型，济南亿健医疗设备有限公司；

分析天平：FALL044型，常州市衡正电子仪器有限公司；

超声波清洗器：KQ5200E型，昆山市超声仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：XMTD-4000型，北京市永光明医疗器械有限公司；

真空泵：SHZ-III型，上海亚荣生化仪器厂；

紫外分光光度计：UV Bluestar A型，北京莱伯泰科仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 雪莲果叶总黄酮的提取 选取新鲜的成熟期雪莲果叶，清洗干净，用鼓风干燥箱在45 ℃干燥15 h，超微粉碎后过60目筛，干燥至恒重备用。称取1.00 g雪莲果叶于150 mL锥形瓶内，加入乙醇溶液，搅拌均匀，200 W超声波辅助一定时间，调节pH值，加入酶后放入恒温水浴锅中反应一定时间后取出，进行真空抽滤。抽滤2～3次将滤液合并倒入100 mL容量瓶，定容至刻度线，测定总黄酮提取率。

1.2.2 总黄酮的测定 采用亚硝酸钠—硝酸铝显色法[21]，得到标准曲线回归方程为A420 nm=1.343 9C-0.005(A420 nm为吸光度；C为芦丁标样浓度，mg/mL)，相关系数R2=0.999 2。按式(1)计算总黄酮提取率。

(1)

式中：

X——总黄酮提取率，%；

M1——测定时样液中黄酮的质量，mg；

V1——样液的体积，mL；

M2——样品的质量，g；

V2——测定时取样液的体积，mL。

1.2.3 试验设计

(1) 不同方法的比较：分别称取1.00 g雪莲果叶粉于3个锥形瓶中，加入50 mL乙醇溶液，标号1、2、3、4。按照1.2.2进行试验：1号瓶中未做超声波及酶处理，2号瓶中加1 mg/mL纤维素酶不做超声波处理，3号瓶用超声波在50 ℃下辅助10 min且不进行酶处理，4号瓶用超声波在50 ℃下辅助10 min后加入1.0 mg/mL纤维素酶，分别测定总黄酮提取率。

(2) 酶种类的确定：探究6种酶(最适pH值，最适温度)[纤维素酶(pH 4.8，50 ℃)、果胶酶(pH 3.5，50 ℃)、木瓜蛋白酶(pH 6.5，60 ℃)、酸性蛋白酶(pH 3.0，40 ℃)、碱性蛋白酶(pH 8.0，50 ℃)和中性蛋白酶(pH 6.9，48 ℃)]对雪莲果叶中总黄酮提取率的影响，以1.00 g雪莲果叶粉为底料，加入50 mL乙醇溶剂，搅拌均匀后超声波处理10 min，加入酶且浓度为0.4 mg/mL，在对应酶的最适pH值及最适温度下进行40 min，分别测定总黄酮提取率。

(3) 单因素试验设计：确定基础试验方法为超声波辅助时间20 min、超声波辅助温度50 ℃、酶质量浓度1 mg/mL、酶解时间40 min、乙醇体积分数60%、料液比(m雪莲果叶∶V乙醇)1∶50 (g/mL)的条件下，分别考察各因素对雪莲果叶总黄酮提取率的影响。各因素水平设计见表1。

(4) 响应面试验设计：在单因素试验的基础上，选取影响较大的因素，以总黄酮提取率为响应值，设计响应面试验。

表1 单因素试验因素水平表

1.2.4 抗氧化能力测定

(1) DPPH·清除能力：参照文献[22]，紫外分光光度计检测波长为517 nm。

(2) 总还原力能力：参照文献[23]，紫外分光光度计检测波长为700 nm。

1.3 数据处理与分析

运用Microsoft Excel 2010、SPSS 17.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法的比较

由图1可知，与仅溶剂提取相比较，在酶和超声波的辅助作用下雪莲果叶总黄酮提取率明显提高，两者同时使用结果最优。选择超声波辅助纤维素酶进行进一步试验。

2.2 酶种类的确定

由图2可知，酶的种类对雪莲果叶黄酮提取率的影响较大，其中纤维素酶处理所得雪莲果叶黄酮提取率最高为5.26%，所以选取纤维素酶结合超声辅助进行进一步试验。

2.3 单因素试验

如图3所示，最佳超声波辅助时间为12 min；最佳超声波辅助温度为50 ℃；最佳酶质量浓度为0.4 mg/mL；最佳料液比(m雪莲果叶∶V乙醇)为1∶50 (g/mL)；最佳乙醇体积分数为20%；酶解时间为60 min。

图1 方法比较结果

2.4 响应面优化试验

2.4.1 响应面试验设计及结果 基于单因素试验结果，超声波辅助时间12 min时提取率最高，随着提取过程的进行，雪莲果叶粉和提取溶剂间的浓度差逐渐减小，超声波时间继续增加可能会破坏黄酮类提取物[22]。超声波辅助温度在50 ℃时结果最好，与纤维素酶的最适温度一致，选取此温度进行下一步试验。在酶浓度为0.4 mg/mL时总黄酮得率最高，说明在此酶浓度下纤维素酶可能已经将雪莲果叶片细胞中的纤维素完全降解[13]。所以固定超声波辅助时间12 min、超声波辅助温度50 ℃、酶质量浓度0.4 mg/mL条件下，选取料液比、酶解时间、乙醇体积分数3个因素，设计三因素三水平的响应面试验，试验因素及水平见表2，响应面试验试验结果见表3。

运用Design-Exert 10.0.4软件对试验数据进行分析处理，得到回归方程为：

Y=5.34+0.37A+0.17B+0.14C+0.14AB+0.071AC-0.079BC+0.15A2-0.21B2+0.20C2。

(2)

对回归模型进行方差分析，结果见表4，该模型极显著(P=0.000 6<0.05)，失拟项不显著(P=0.399 3>0.05)，说明该模型能较准确反映3个因素对雪莲果叶总黄酮提取率的影响，从F值得出各因素对雪莲果叶总黄酮提取率的影响从大到小依次为料液比>酶解时间>乙醇体积分数。校正系数R2=0.956 2，说明95.62%以上的数据能用此方程解释，拟合度较好，可用于超声波酶法提取雪莲果叶中总黄酮工艺的试验预测及分析。

图2 酶种类对比结果

图3 各因素对雪莲果叶总黄酮提取率的影响

表2 响应面试验因素及水平

2.4.2 各因素交互作用分析 由图4～6可知：料液比与酶解时间的等高线较陡峭，说明二者的交互作用明显且料液比对总黄酮提取率的影响更大；料液比与乙醇体积分数交互作用的等高线的形状表现接近圆形，说明两个因素的相互影响效果不明显；酶解时间和乙醇体积分数的等高线形成的坡面的走势较为陡峭，说明酶解时间对雪莲果叶总黄酮提取率的影响比料液比的强，交互作用明显。

2.4.3 验证实验 利用Design-Exert 10.0.4软件优化试验结果，得最佳工艺条件为料液比(m雪莲果叶∶V乙醇)1∶60 (g/mL)，酶解时间65.55 min，乙醇体积分数29.67%，此条件下总黄酮提取率理论可达6.335%。考虑到实际的可操作性，将酶解时间调整为66.00 min。实际验证实验的条件为：乙醇体积分数30%、酶质量浓度0.4 mg/mL、料液比(m雪莲果叶∶V乙醇)1∶60 (g/mL)、酶解66 min、在50 ℃下超声处理12 min，实际提取率为6.317%，与理论值相对误差为0.28%，模型预测性较好且稳定，可用于雪莲果叶中总黄酮的提取。

2.5 雪莲果叶总黄酮抗氧化能力

由图7可知，在所选浓度范围内，雪莲果叶总黄酮粗提取物对于DPPH·有明显的清除能力(IC50=0.25 mg/mL)。其清除能力略低于维生素C，高于红景天、何首乌及石榴皮[24]等，表明雪莲果叶总黄酮提取液具有较高的抗氧化活性。由图8可知，总还原力与浓度的关系与DPPH·清除能力测定结果相似，抗氧化能力大小与浓度线性正相关，呈剂量依赖关系。说明雪莲果叶中总黄酮粗提取物具有明显的抗氧化效果。

表3 响应面试验结果

表4 回归模型方差分析†

图4 料液比和酶解时间对总黄酮提取率的影响

图5 料液比和乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

图6 酶解时间和乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

图7 雪莲果叶中总黄酮提取液和维生素C对DPPH·清除能力的比较

图8 雪莲果叶中总黄酮提取液和维生素C总还原能力的比较

3 结论

超声波辅助酶法提取雪莲果叶总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数30%、酶质量浓度0.4 mg/mL、料液比(m雪莲果叶∶V乙醇)1∶50 (g/mL)、酶解时间62 min、超声温度50 ℃、超声时间12 min，该最佳工艺下雪莲果叶中总黄酮提取率可达6.317%，高于陈红惠等[25]报道的53.41 mg/g。体外抗氧化活性表明，在测试浓度范围内，雪莲果叶提取液对DPPH自由基具有较好的清除能力及较好的总还原力。试验仅对雪莲果叶总黄酮的抗氧化活性进行了初步探究，尚未对抗氧化成分进行定量分离，后续可对雪莲果叶黄酮类成分进行定量分析及化学成分分析。