宋 玄,王泽华,单 双,张永军,王山宁,*

(1.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所,北京 100097;2.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193;3.中国农业大学植物保护学院,北京 100193)

白蜡窄吉丁Agrilusplanipennis，又名花曲柳窄吉丁、梣小吉丁，属鞘翅目(Coleoptera)吉丁科(Buprestidae)，主要为害木犀科(Oleaceae)白蜡属Fraxinus树木(魏霞等,2004;赵同海等,2005)。该虫原产于东亚，自2002年传入北美，因其隐蔽性强，防治极为困难，迄今已造成北美地区数百万白蜡树死亡，严重威胁多种白蜡属树木的生存(Anulewiczetal.,2008;Herms and McCullough,2014;Wendyetal.,2018)。气味分子介导的该虫寄主识别和种间通讯已经被证实。白蜡叶片挥发物中至少发现16种化合物能诱发成虫触角电位反应，如顺-3-己烯醇、乙酸顺-3-己烯酯、反-2-己烯醛等，其中顺-3-己烯醇对雄虫有很强的诱集作用(Rodriguez-Saonaetal.,2006)。白蜡树皮挥发物中的6种倍半萜，包括α-蒎烯、α-可巴烯、α-葎草烯等均对成虫具有触角活性，含有这些化合物的两种植物油manuka oil和phoebe oil在野外对成虫具有诱捕效果(Crooketal.,2008b)。白蜡窄吉丁雌虫释放的具有触角活性的化合物(3Z)-lactone能够吸引雄性，被认为是该虫的性信息素组分(Barteltetal.,2007)。目前已经根据寄主植物挥发物和性信息素研制开发了白蜡窄吉丁的多种引诱剂(Crooketal.,2008b;Silketal.,2015,2019;Katieetal.,2020)。但是，人们对该虫的化学通讯分子机制还不太了解。

昆虫感知外界化学信息的过程中，气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、气味受体(odorant receptors,ORs)和离子型受体(ionotropic receptors,IRs)等多种嗅觉相关蛋白发挥至关重要的作用(Clyneetal.,1999;Coutoetal.,2005;Bentonetal.,2009;Leal,2013;Joseph and Carlson,2015)。昆虫气味结合蛋白(OBPs)是一类小分子的水溶性蛋白，此类蛋白广泛分布在昆虫的各类感受器官中(Pelosietal.,2018)。在昆虫触角中，OBP蛋白由位于化学感受器下方的辅助细胞合成，随后被大量分泌到感器腔的淋巴液中，参与结合、溶解、运输疏水性气味分子，在昆虫感受外界环境中的化学信号过程中发挥重要功能(Vogt and Riddiford,1981;Angelietal.,1999;Leal,2013;Pelosietal.,2014,2018)。

昆虫气味结合蛋白广泛存在不同昆虫中，参与昆虫信息化合物的识别。在鞘翅目昆虫大黑鳃金龟Holotrichiaoblita触角转录组中鉴定出29个OBP基因，其中HoblOBP9和HoblOBP13分别参与大黑鳃金龟雌虫对寄主植物挥发物苯乙醇和反-2-苯烯醇的识别(Yinetal.,2019)。松墨天牛MonochamusalternatusMaltOBP1,MaltOBP3和MaltOBP5能够与部分寄主植物挥发物结合，它们可能在松墨天牛的寄主选择过程发挥功能(Gao and Wang,2015;Zhangetal.,2020)。苹果小吉丁AgrilusmaliAmalOBP3在雌雄触角中高表达，能够结合醇类和醛类等多种寄主挥发物(Cuietal.,2018)。本实验室前期对白蜡窄吉丁基因组数据进行分析，鉴定了11个气味结合蛋白，组织表达谱结果表明AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3在雌雄成虫触角特异表达，荧光竞争结合实验表明AplaOBP1和AplaOBP2能够与多种寄主挥发物结合，它们在白蜡窄吉丁寄主识别中发挥功能(Wangetal.,2020;宋玄等,未发表数据)，推测AplaOBP3同样在白蜡窄吉丁嗅觉感受行为中发挥功能。

为深入解析气味结合蛋白在白蜡窄吉丁嗅觉感受中的功能，本研究进一步对AplaOBP3蛋白进行了原核表达，利用免疫组化技术检测了该蛋白的亚细胞定位，通过荧光竞争结合实验对AplaOBP3重组蛋白与58种化合物的结合特性进行了分析，并对3种气味结合蛋白(AplaOBP1-3)的表达及配体结合特性进行比较，以期为阐明白蜡窄吉丁气味结合蛋白参与寄主识别的化学感受机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

于北京郊区白蜡林地，将受害白蜡树截成约50 cm的木段带回室内，置于养虫笼罩内待白蜡窄吉丁成虫自然羽化，成虫羽化后转移至养虫盒内，饲喂白蜡树叶片进行饲养，成虫饲养条件为温度25±0.5℃，相对湿度60%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 AplaOBP3重组蛋白的表达与纯化

利用SignalP 3.0 Server在线程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)预测白蜡窄吉丁AplaOBP3蛋白(GenBank登录号:XM_025977151.1)信号肽序列，去信号肽后的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司进行化学合成并克隆到原核表达载体pET30a(+)，转化大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)。将单克隆阳性菌株接种于含100 mg/mL卡那霉素的培养基中37℃ 200 r/min摇床中培养，待OD600值为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，在18℃ 160 r/min摇床中诱导16 h。超声破碎后分别收集上清及包涵体。参照Prestwich (1993)的方法，进行包涵体的复性和重折叠，即用含0.2% Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)冲洗包涵体，随后将包涵体溶解在6 mol/L的盐酸胍中，经氧化还原处理后获得可溶性蛋白。利用亲和层析镍柱纯化，纯化的重组蛋白经肠激酶25℃孵育过夜处理后，再次用亲和层析镍柱纯化，超滤浓缩后得到无His标签的AplaOBP3重组蛋白。通过4%～20% SDS-PAGE电泳检测各阶段目的蛋白的表达及纯化情况。纯化的目的蛋白送北京信诺晶科生物技术有限公司制备多克隆抗体。

1.3 Western blot检测

收集白蜡窄吉丁成虫触角，使用组织蛋白抽提试剂盒(康为世纪生物科技有限公司,北京)提取触角组织粗蛋白。采用4%-20% SDS-PAGE电泳对触角组织粗蛋白和纯化的重组蛋白AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3进行分离，其中AplaOBP1和AplaOBP2重组蛋白由本实验室前期实验获得(Wangetal.,2020;宋玄等,数据未发表)。采用One Step Western Kit HRP(Rabbit)(康为世纪生物科技有限公司,北京)进行Western blot，检测AplaOBP3多克隆抗体的特异性；通过高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪生物科技有限公司,北京)进行发光检测；使用化学发光成像分析仪(AI680,GE,美国)进行曝光及图像采集。

1.4 免疫组织化学定位检测

1.3节收集的白蜡窄吉丁触角样品送至中国农业科学院农产品加工研究所电镜室进行固定、制样包埋、切片、免疫染色及电镜观察。1.2节制备的AplaOBP3多克隆抗体按照1∶5 000 (v/v)稀释使用，以未免疫的兔血清代替抗体作为阴性对照，详细步骤参照本实验室前期报道(Wangetal.,2020)，检测AplaOBP3在白蜡窄吉丁触角感器中的表达定位。

1.5 荧光竞争结合实验

为了与前期报道的白蜡窄吉丁AplaOBP1和AplaOBP2蛋白的配体结合特性进行比较，本研究选取了58种相同的化合物作为候选配体(表1)，其中27种挥发物的选择是来自于白蜡窄吉丁为害的寄主植物。使用F-380荧光分光光度计(天津港东科技发展股份有限公司)进行荧光竞争结合实验，激发波长337 nm，扫描发射波长范围370～550 nm。采用N-苯基-1-萘胺 (N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光探针。候选配体和荧光探针用色谱级甲醇溶解，配制成浓度为1 mmol/L的工作液。于PBS缓冲液(pH 7.4)中加入AplaOBP3重组蛋白，终浓度为2 μmol/L，再加入1-NPN，使探针浓度从2 μmol/L递增至12 μmol/L，重复3次，测定荧光强度变化，计算AplaOBP3与探针的结合能力曲线和解离常数。将AplaOBP3加入PBS缓冲液(pH 7.4)中，终浓度为2 μmol/L，加入相同浓度的1-NPN，记录荧光强度，随后加入待测配体，浓度从2 μmol/L开始递增至20 μmol/L，记录荧光强度变化，重复3次。计算得出使荧光强度降低一半时的配体浓度，即IC50值。利用下列公式计算出配体解离常数KD∶KD=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，[1-NPN]是未结合的1-NPN的浓度，K1-NPN为AplaOBP3与1-NPN的解离常数(Guetal.,2011)。

2 结果

2.1 AplaOBP3的重组表达

SDS-PAGE结果表明，气味结合蛋白AplaOBP3重组蛋白在包涵体中表达(图1)，对包涵体进行复性，通过亲和层析获得重组蛋白，肠激酶切去His标签后得到分子量约为14 kD的目的蛋白，用于抗体制备及竞争性结合实验。

2.2 Western blot检测

Western blot检测了AplaOBP3多克隆抗体与白蜡窄吉丁触角粗蛋白以及纯化的AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3重组蛋白的结合特异性，结果表明，仅在触角粗蛋白和AplaOBP3蛋白样品中检测到分子量约14 kD特异性条带，表明AplaOBP3多克隆抗体仅与AplaOBP3蛋白结合，可以满足后续的免疫组织化学检测(图2)。

2.3 AplaOBP3在触角中的表达定位

免疫组化结果表明，黑色胶体金颗粒标记的AplaOBP3蛋白分布在白蜡窄吉丁锥形感器类型Ⅰ的感器腔及感器下方(图3)。锥形感器类型Ⅰ的感器壁具有明显的微孔，是嗅觉感受器，推测AplaOBP3蛋白在白蜡窄吉丁嗅觉感受过程中发挥着重要的作用。

图1 白蜡窄吉丁重组蛋白AplaOBP3的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennisM:蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker;1:未诱导的大肠杆菌菌体Non-induced Escherichia coli;2:经IPTG诱导16 h的大肠杆菌菌体E.coli induced by 1 mmol/L IPTG for 16 h;3:上清液Supernatant;4:包涵体蛋白Inclusion body protein;5:带His标签重组蛋白AplaOBP3 Recombinant AplaOBP3 with His-tag;6:无His标签的重组蛋白AplaOBP3 Recombinant AplaOBP3 without His-tag.

图2 白蜡窄吉丁AplaOBP3多克隆抗体的SDS-PAGE (A)和Western blot (B)检测Fig.2 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of the polyclonal antibody against AplaOBP3 of Agrilus planipennisM:蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker;1:提取自白蜡窄吉丁的触角粗蛋白Crude protein extracted from antennae of A.planipennis;2:AplaOBP1重组蛋白Recombinant AplaOBP1;3:AplaOBP2重组蛋白Recombinant AplaOBP2;4:AplaOBP3重组蛋白Recombinant AplaOBP3.

图3 AplaOBP3蛋白在白蜡窄吉丁触角的表达定位Fig.3 Expression localization of AplaOBP3 protein in the antenna of Agrilus planipennisA:显示黑色颗粒标记的AplaOBP3蛋白分布在锥形感器类型Ⅰ的感器腔及感器基部的纵切图Longitudinal section showing that AplaOBP3 proteins labeled with black spots are distributed in the hair lumen and the base of the sensilla basiconica type I;B:锥形感器类型Ⅰ的感器腔Hair lumen of the sensilla basiconica type I;C:锥形感器类型Ⅰ的感器基部Base of the sensilla basiconica type I；D:显示AplaOBP3蛋白在锥形感器类型Ⅰ的感器腔中表达的横切图,箭头表示感器上的壁孔Cross section showing the expression of AplaOBP3 protein at the hair lumen of sensilla basiconica type I,arrows indicating the wall pores on the sensillum;E:显示未免疫的兔血清阴性对照未被标记的纵切图Longitudinal section showing that the negative control of unimmunized rabbit serum was not labeled;F:显示未免疫的兔血清阴性对照未被标记的横切图Cross section showing that the negative control of unimmunized rabbit serum was not labeled.

2.4 AplaOBP3重组蛋白配体结合特征

荧光竞争结合实验结果表明，AplaOBP3与荧光探针1-NPN的解离常数为0.4 μmol/L，1-NPN和重组蛋白AplaOBP3的结合曲线及Scatchard方程见图4 (A)。AplaOBP3与候选配体的结合曲线(图4:B)和解离常数(表1)可以看出，在58种气味挥发物中，AplaOBP3可以特异性结合反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮、β-紫罗兰酮和罗勒烯，AplaOBP3与β-紫罗兰酮结合能力最强，解离常数为1.72 μmol/L，与苯甲醛的结合能力次之，其解离常数为4.03 μmol/L，与反-2-己烯醛的结合能力最弱，其解离常数为6.20 μmol/L。

2.5 AplaOBP3与AplaOBP1和AplaOBP2的表达及配体结合特性比较

AplaOBP3与前期报道的白蜡窄吉丁AplaOBP1和AplaOBP2蛋白的表达及配体结合特性(表2)进行比较发现，AplaOBP3与AplaOBP2具有相似的表达及配体结合特性，但与AplaOBP1的明显不同。AplaOBP3和AplaOBP2均在触角锥形感器类型I表达，而AplaOBP1在锥形感器类型I和III均表达。在58种候选配体中，共有15种化合物至少与一种AplaOBP重组蛋白结合。与AplaOBP3结合的5种配体中，其中4种(反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮和β-紫罗兰酮)也与AplaOBP2结合，而与AplaOBP1结合的多数配体与AplaOBP3和AplaOBP2不结合，其中仅罗勒烯与AplaOBP3结合。

图4 白蜡窄吉丁重组蛋白AplaOBP3的结合特征Fig.4 Binding properties of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennisA:1-NPN和AplaOBP3的结合曲线及Scatchard方程Binding curve and Scatchard plot of 1-NPN to AplaOBP3;B:AplaOBP3与候选配体的结合曲线Binding curves of AplaOBP3 to candidate ligands.

3 讨论

白蜡窄吉丁触角上分布有3种多孔的锥形感器，在雌雄成虫感受外界嗅觉刺激信号中发挥着重要的作用(Crooketal.,2008a)。免疫组化结果表明，AplaOBP3蛋白在白蜡窄吉丁锥形感器类型I中表达，推测AplaOBP3可能与嗅觉感受有关。本研究选择58种挥发物作为候选配体，其中包括27种寄主挥发物，AplaOBP3重组蛋白能与多种挥发物结合，其中与AplaOBP3重组蛋白结合的5种配体中，3种配体即罗勒烯、反-2-己烯醛和4′-乙基苯乙酮属于白蜡窄吉丁寄主植物白蜡树的叶片挥发物，它们可以引起白蜡窄吉丁EAG反应，并且反-2-己烯醛对白蜡窄吉丁具有吸引作用(Rigsbyetal.,2017;Wangetal.,2020;宋玄等,未发表数据)，表明AplaOBP3可能在白蜡窄吉丁选择寄主植物过程中发挥重要嗅觉感受功能。AplaOBP3和AplaOBP2表现出大致相同的表达及配体结合特征，它们均可结合反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮和β-紫罗兰酮。Zhong等(2018)的研究发现茶翅蝽5种OBPs与报警信息素组分反-2-癸烯醛具有强的结合能力。苹果小吉丁OBP2和OBP8与十二醇、橙花醇、法尼醇和十二烷等多种配体均具有强的结合能力(Cuietal.,2018)。因此，昆虫中不同种类的气味结合蛋白能够结合同一种挥发物，推测可能共同参与某种化合物的识别。

表1 白蜡窄吉丁重组蛋白AplaOBP3与候选配体结合能力Table 1 Binding capabilities of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennis to candidate ligands

续表1 Table 1 continued

表2 3种AplaOBP蛋白表达及配体结合特征比较Table 2 Comparison of expression and ligand binding characteristics of three AplaOBP proteins

顺-3-己烯醇是白蜡叶片挥发物重要组分，其可以引起白蜡窄吉丁的EAG反应，且对白蜡窄吉丁具有诱集活性，已应用于商业化诱饵关键组分(Rodriguez-Saonaetal.,2006;Grantetal.,2010,2011)。目前，未发现一种AplaOBP蛋白能够与顺-3-己烯醇结合。白蜡窄吉丁11个AplaOBPs中，除触角特异表达的3个AplaOBPs以外，AplaOBP6和AplaOBP7基因在触角的表达量高于其他组织(Wangetal.,2020)，它们是否能够与顺-3-己烯醇结合还需进一步实验研究。另外，其他水溶性转运蛋白如化学感受蛋白(CSPs)也可能参与寄主挥发物的识别。Andersson等(2019)对白蜡窄吉丁基因组进行分析，共注释了14个AplaCSPs基因。目前，关于AplaCSPs在白蜡窄吉丁化学感受中的功能未见报道。我们推测触角特异或高表达的AplaCSPs也很有可能参与顺-3-己烯醇等寄主挥发物的识别。

综上，本研究对白蜡窄吉丁AplaOBP3蛋白在触角感器中的定位进行了解析，通过体外功能研究的方法证明AplaOBP3可能参与白蜡窄吉丁对寄主植物挥发物的识别，同时比较了AplaOBP3与已报道的AplaOBP1和AplaOBP2的配体结合异同，为阐明气味结合蛋白在白蜡窄吉丁寄主识别中的功能奠定了一定基础，也为基于气味结合蛋白的功能筛选白蜡窄吉丁新的信息化合物提供了依据。然而，对于气味结合蛋白在白蜡窄吉丁寄主识别中的具体生理功能还需进一步通过基因干扰或基因编辑进行验证。