陈晓晨 ，韩泽亮，张剑宇，黄振佳，尹乃毅，刘宪华，刁国旺，徐开钦

1.福州大学环境与资源学院/福建省农村废弃物绿色循环技术工程研究中心，福建 福州 350108；2.江苏隆昌化工有限公司，江苏 如皋 226532；3.中国科学院大学资源与环境学院，北京 101408；4.天津大学环境科学与工程学院，天津 300072；5.扬州大学化学化工学院，江苏 扬州 225002；6.日本国立环境研究所资源循环废弃物研究中心，筑波 305-8506

铅（Pb）是一种广泛存在的重金属元素，而采矿、冶炼、含铅燃料燃烧以及农业化学品的不当使用等一系列的人为活动导致严重的土壤铅污染，成为世界范围内的关注焦点（秦鹏等，2014）。作为一种毒性较强的非必需元素，铅可通过食物链、直接经口部摄入、呼吸以及皮肤接触等途径进入人体，进而对神经系统、循环系统和造血系统等造成损害（Zhou et al.，2020）。由于各国对食物链等暴露途径进行了严格管控，对于长期从事户外工作却缺乏防护的人员以及卫生意识较淡薄的儿童而言，口部摄入已成为其铅摄入的最主要途径（Li et al.，2015a；Lin et al.，2017）。为及时遏止土壤污染及其危害的扩大化，近年来中国颁布了《土壤污染防治行动计划》（“土十条”）及《土壤污染防治法》等里程碑式的法规文件。积极开展土壤环境质量状况调查评估、准确掌握土壤铅等污染物的健康风险信息，具有重要的科学价值和社会意义。

目前，土壤污染物的健康风险评估方法大多仍是基于其重金属质量分数，包括中国新近发布的《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准》（GB 36600—2018）（生态环境部，2018）以及美国推荐的人体健康风险评估模型（USEPA，2007；USEPA，1991）等均是如此。然而，由于实际经口部摄入的土壤污染物并不会 100%被人体消化吸收进而进入体循环，这些方法往往导致对健康风险的过高估计（Liang et al.，2016）。近年来，基于土壤污染物的生物可给性（bioaccessibility）来更为精确地评估其对人体健康风险的体外试验（in vitrotest）方法学得到长足发展，其可通过在体外模拟人体消化系统，获取摄入人体的土壤铅在胃肠道中溶出的百分比（即铅的生物可给性）信息，掌握人体所能吸收的铅的最高值（Ruby et al.，1996）。已见报道的体外试验模型有很多，包括Ruby et al.（1996）提出的PBET（Physiologically Based Extraction Test）模型、Rodriguez et al.（1999）提出的IVG（In Vitro Gastrointestinal）模型、DIN（2000）提出的 DIN（Deutsches Institut füer Normung）模型、Wragg et al.（2011）提出的 UBM（unified BARGE method）模型等。因提出较早、与动物试验（invivotest）结果相关性好、应用广泛，PBET和 IVG模型被公认为研究土壤铅的生物可给性的最适宜的体外试验模型之二（Li et al.，2017；Juhasz et al.，2016）。

随着体外试验模型被广泛应用于健康风险评估，探索土壤铅等重金属污染物的生物可给性的影响因素成为该领域的热点，而以往的研究主要涉及了多种土壤理化性质以及铅的赋存形态。在土壤理化性质方面，pH和有机质报道较多。Van de Wiele et al.（2007）发现土壤pH对铅的生物可给性影响并不显著，而郑顺安等（2013）的研究却表明土壤pH的提高可显著降低铅的生物可给性，Du et al.（2019）更是认为可以通过土壤pH实现对铅的生物可给性的预测。De Miguel et al.（2012）发现土壤有机质可以作为预测铅的生物可给性的指标之一，Saminathan et al.（2010）的研究表明较高的有机质质量分数可显著降低铅的生物可给性，而罗梅等（2020）发现土壤中小分子量的腐殖酸可有效提高铅的生物可给性。此外，土壤质地（Ma et al.，2019；Zong et al.，2016）、阳离子交换量（Yan et al.，2019；Wijayawardena et al.，2015）、无定形铁锰氧化物（Yang et al.，2002；尹乃毅等，2014）以及铅的 CaCl2提取态（Mahar et al.，2015；李岩等，2019）等都曾被报道为可能是土壤铅的生物可给性的影响要素，尽管所得研究结论亦不尽相同。在铅的赋存形态方面，经典的Tessier连续提取法（Tessier et al.，1979）及其若干改进版均是解析土壤铅化学形态的重要技术手段。Ai et al.（2019）发现土壤铅的可交换态、碳酸盐结合态与其生物可给性显著相关，而Li et al.（2015b）的研究则进一步发现铁锰氧化物结合态同样与其生物可给性关系密切。尽管前人在土壤理化性质、铅的赋存形态与土壤铅的生物可给性之间的关系方面做了大量研究工作，但仍然得到了很多无定论甚至是相互矛盾的结论。究其原因，一方面，这些研究多只针对区域性的或随机的、个别的土壤样品，未能在较大空间尺度上涵盖多种代表类型土壤，其结果具有明显的局限性；另一方面，以往的研究多仅针对若干影响因素独立地进行探究，缺乏对各类可能影响因素的全面综合的系统性研究。

综上所述，本研究针对人工制备铅污染的红壤、褐土、黑土、棕壤和黄壤这五种中国典型土壤，结合体外试验方法（改进的 PBET模型），精确获知其经口部途径摄入人体后铅的生物可给性及相应的健康风险，进而从土壤理化性质和铅的赋存形态角度，全面综合地探讨其对土壤铅的生物可给性的影响。相关研究成果将为今后在中国开展大范围的实地铅污染土壤健康风险评估工作提供准确的科学依据与有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 铅污染土壤的制备

采集红壤（福建）、褐土（北京）、黑土（黑龙江）、棕壤（江苏）及黄壤（湖南）这五种中国典型土壤，风干、磨碎，过2 mm筛后待用。根据《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准》（GB 36600—2018）一类用地管制值，采用人工掺混[Pb(NO3)2]的方式（Tang et al.，2008），制备成铅质量分数为800 mg·kg−1的污染土壤。其间，保持各土壤含水率约30%（Zhang et al.，2015），培养1个月。之后，将其风干、磨碎，过2 mm和0.15 mm筛。其中过2 mm筛的用于土壤pH、质地（粘粒质量分数）及CaCl2提取态铅质量分数测定，过0.15 mm筛的用于土壤有机质质量分数、阳离子交换量、无定形铁锰氧化物质量分数测定，以及铅的赋存形态分析和体外试验。每个分析项目均重复3次。

1.2 铅污染土壤性质分析

1.2.1 土壤理化性质

土壤pH采用CaCl2提取法，土液比为1∶2.5，pH计（PHS-3C，雷磁，中国）测定（鲁如坤，2000）12-13。有机质质量分数采用水合热 K2Cr2O7比色法测定（鲁如坤，2000）109-110。质地（粘粒质量分数）采用比重计法，甲种比重计测定（鲁如坤，2000）282-284。阳离子交换量采用BaCl2提取法（Hendershot et al.，1986）；无定形铁锰氧化物质量分数采用H2C2O4-(NH4)2C2O4提取法（Klute，1986）；CaCl2提取态铅质量分数采用CaCl2溶液浸提（Pueyo et al.，2004）；上述提取液中金属元素质量浓度测定使用ICP-OES（Optima，美国）。

1.2.2 土壤铅的赋存形态

（1）改进的Tessier连续提取法（Tang et al.，2008）

该方法将土壤中铅区分为水溶态（F1）、可交换态（F2）、碳酸盐结合态（F3）、铁锰氧化物结合态（F4）、有机结合态（F5）和残渣态（F6）。每个形态的提取液经离心和0.45 μm膜过滤，其铅质量浓度测定使用 ICP-MS（ThermoFisher，X SERIES II，美国）。

（2）迁移系数

F1、F2、F3的铅在土壤中有较强的迁移能力，通常被认为是可能对环境造成较严重危害的赋存形态。Taghlidabad et al.（2018）用迁移系数（mobility factor）表征其在土壤总铅中的比例，本文中由于涉及方法学引入了铅的水溶态故将其公式在此基础上定义如下：

1.3 体外试验

1.3.1 实验方法

采用PBET模型（Ruby et al.，1996），并参考IVG模型（Rodriguez et al.，1999）进行改进，模拟人体胃肠道的消化过程，具体步骤如下：

胃阶段：每批样品配置 1 L胃液（其中包含8.775 g氯化钠、0.50 g柠檬酸、0.50 g苹果酸、0.42 mL 乳酸和 0.50 mL 冰乙酸），用 12 mol·L−1浓盐酸调节pH至1.5，加1.25 g胃蛋白酶（Porcine Pepsin P 7000，Sigma-Aldrich，美国）。分别称量0.3 g过0.15 mm筛铅污染土壤至两根50 mL聚丙烯锥形离心管中，各加入30 mL模拟胃液，置于恒温震荡仪中，在 37 ℃、150 r·min−1条件下振荡 1 h后取出其中一根离心管。用一次性注射器吸取 10 mL反应液，0.45 μm膜过滤，4 ℃保存待测，采用ICP-MS测定铅质量浓度。

小肠阶段：进一步向胃阶段剩余的另一根 50 mL聚丙烯锥形离心管中加入NaHCO3粉末，将反应液 pH调至 7.0，加入 0.018 g胰酶（Porcine Pancreatin P1500，Sigma-Aldrich，美国）和0.06 g胆盐（Bile Extract B8631，Sigma-Aldrich，美国），在与胃阶段相同的温度和振荡条件下继续反应 4 h。其间，间隔30 min测定反应液pH值，若偏离中性条件，则用 12 mol·L−1的浓 HCl或 NaHCO3粉末微调。用一次性注射器吸取10 mL反应液，0.45 μm膜过滤，4 ℃保存待测，采用 ICP-MS测定铅质量浓度。

1.3.2 土壤铅的生物可给性计算

式中，fBAC为土壤铅的生物可给性（%）；ρiv是胃或小肠阶段消化液中生物可溶态铅的质量浓度（mg·L−1）；viv为胃或小肠阶段反应液的体积（L），本实验为 0.03 L；ωs是土壤中铅质量分数（mg·kg−1），本实验为 800 mg·kg−1；ms为土壤质量（kg），本实验为0.0003 kg。

1.3.3 土壤铅对人体的健康风险评估

采用 USEPA推荐的人体健康风险评估模型（USEPA，2007；USEPA，1991），并基于体外试验获得的铅的生物可给性值对公式进行修正，以实现对土壤铅的非致癌风险更加准确的评估，公式如下：

式中，HQ为土壤铅的非致癌风险，若超过 1则表示该土壤可能引发不良健康效应；CDIm为经口部摄入铅的日均暴露剂量（mg·kg−1·d−1）；fBAC为土壤铅在胃或小肠阶段的生物可给性（%）；RfD为经口部摄入铅的参考剂量（mg·kg−1·d−1），为3.5×10−3mg·kg−1·d−1；ωs为土壤中铅质量分数，本实验为 800 mg·kg−1；ImR为每日土壤摄入量（mg·d−1），儿童为 200 mg·d−1，成人为 100 mg·d−1；CF为单位转换因子，为 10−6；EF为暴露频率（d·a−1），为 350 d·a−1；ED 为暴露持续时间（a），儿童为6 a，成人为30 a；BW为人体质量（kg），儿童为16.2 kg，成人为61.8 kg；AT为平均暴露时间（d），为 ED×365 d。

1.4 数据分析

采用SPSS 20.0进行统计学分析，Origin 9.1进行图表绘制。

2 结果与讨论

2.1 土壤铅的生物可给性及其健康风险

2.1.1 土壤铅的生物可给性

胃和小肠阶段土壤铅的生物可给态质量分数及生物可给性见图1。胃阶段土壤铅的生物可给性为72.7%—82.6%，小肠阶段为22.8%—27.7%，前者极显著高于后者（P＜0.01）。这与付瑾等（2012）的研究结果一致，主要是由于从胃阶段进入小肠阶段后 pH急剧升高且伴随着 CO32−质量浓度增加，致使胃阶段溶出进入消化液中的铅发生了沉淀或重吸附到土体上（郑顺安等，2013）。该现象涉及的机理可能较为多样，在小肠阶段的中性pH条件下，铅自身的沉淀作用可能是主导，而铁的沉淀物及其氧化物对铅的再吸附以及土壤有机质更易于将铅络合等都可能发挥重要作用（Li et al.，2020；Yang et al.，2006）。此外，胃阶段不同土壤间铅的生物可给性存在极显著差异（P＜0.01），而小肠阶段不同土壤间铅的生物可给性无显著差异（P＞0.05）。

图1 土壤铅在胃阶段与小肠阶段的生物可给态质量分数/生物可给性Fig.1 Bioaccessible concentration/bioaccessibility of soil Pb in gastric and small intestinal phases

2.1.2 土壤铅的健康风险

经口部摄入的土壤铅对人体的非致癌风险见表1。

表1 经口部摄入的土壤铅对人体的非致癌风险Table 1 Non-carcinogenic risks of soil Pb through oral ingestion

在胃阶段，5种土壤铅对成人和儿童的非致癌风险范围分别为0.26—0.29和1.97—2.23，后者极显著高于前者（P＜0.01），平均达到前者的7.6倍，且各土壤铅对儿童的非致癌风险均超过可接受限值1，平均达到2.1倍。不同土壤间铅对人体的非致癌风险存在极显著差异（P＜0.01）。

在小肠阶段，5种土壤铅对成人和儿童的非致癌风险范围分别为0.08—0.10和0.62—0.75，后者极显著高于前者（P＜0.01），平均达到前者的7.6倍，但二者均未超过可接受限值1。不同土壤间铅对人体的非致癌风险无显著差异（P＞0.05）。

此外，与前述土壤铅的生物可给性的结果相同，无论对于成人还是儿童而言，在胃阶段土壤铅的非致癌风险极显著高于小肠阶段（P＜0.01），在人体最主要的消化和吸收器官（小肠）中铅的非致癌风险平均降低了67.5%，而该现象还导致铅的非致癌风险的土壤间差异不复存在了。

2.2 土壤铅的生物可给性的影响因素

2.2.1 土壤理化性质

铅污染土壤的理化性质见表2。

表2 铅污染土壤的理化性质Table 2 Physicochemical properties of Pb-contaminated soils

土壤理化性质与土壤铅的生物可给性之间的相关性见表3。在胃和小肠阶段，土壤pH和有机质质量分数均与土壤铅的生物可给性呈高度显著负相关（P＜0.05）。

表3 土壤理化性质与土壤铅生物可给性之间的相关性Table 3 Correlations between soil physiochemical properties and bioaccessibility of soil Pb

2.2.2 土壤铅的赋存形态

土壤铅的各赋存形态及其占总铅的百分比见图2。迁移系数的排序为红壤 (73%)＞棕壤 (38%)＞褐土(36%)＞黄壤 (30%)＞黑土 (17%)，平均为 39%。不同土壤间迁移系数存在极显著差异（P＜0.01）。

图2 土壤铅的赋存形态及其占总铅的比例Fig.2 Fractions of soil Pb and their proportions to the total Pb

迁移系数与土壤铅的生物可给性之间的相关性见表4。在胃和小肠阶段，迁移系数与土壤铅的生物可给性呈高度显著正相关（P＜0.05）。

表4 迁移系数与土壤铅的生物可给性之间的相关性Table 4 Correlations between mobility factor and bioaccessibility of soil Pb

2.2.3 影响因素的多元回归

进一步对土壤铅的生物可给性（因变量）的可能影响因素（自变量）进行逐步多元回归分析，以此消除各因素间的多重共线性问题，结果见表5。可以看出，仅有土壤pH是土壤铅在胃肠道的生物可给性的主导因子。

表5 土壤铅的生物可给性的影响因素的多元回归Table 5 Multivariate regression between bioaccessibility of soil Pb and the influencing factors

2.2.4 土壤间差异的机理分析

综上所述，经口部摄入的土壤铅在人体胃肠道的生物可给性与土壤 pH、有机质质量分数以及迁移系数有着密切关联。在消除各因素间的多重共线性问题后，土壤pH被证实是土壤铅在胃肠道的生物可给性的主导因子。以此为基础，对铅的生物可给性的土壤间差异进行机理分析推断，并给予今后进一步的验证性实验研究以启示。

土壤pH与土壤铅的生物可给性呈高度显著负相关，这与Yang et al.（2006）的研究结果一致，且土壤pH是土壤铅的生物可给性的主导因子。较高的土壤pH有利于铅与羟基形成复合物，可在一定程度上削弱铅的溶解释出；另外OH−可进一步削弱H+对交换位点竞争的能力，减少土壤中游离的铅离子含量；还有学者认为，pH较高的土壤中粘土矿物、水合氧化物、有机质等表面负电荷较多，可增强对铅的吸附（Yang et al.，2006；郑顺安等，2013；Yang et al.，2015）。因此，pH值最低的红壤中铅的生物可给性较高；而pH值最高的黑土中铅的生物可给性较低。

有机质质量分数虽不是直接影响土壤铅的生物可给性的主导因子，但其与土壤铅的生物可给性呈高度显著负相关，这与Saminathan et al.（2010）的研究结果一致。有机质表面具有大量的官能团，如羧基、氨基、羟基等都与铅有着较高的亲和力，而大分子固体腐殖质可与铅形成络合物并具有较高的稳定性（罗梅等，2020）。此外，带负电荷的有机质可吸附铅离子（Udovic et al.，2012）。因此，有机质质量分数最低的红壤中铅的生物可给性较高；而有机质质量分数最高的黑土中铅的生物可给性较低。

迁移系数与土壤铅的生物可给性呈高度显著正相关。F1、F2、F3通常被认为是土壤中较活跃、易溶出的铅的赋存形态，因此在模拟人体胃肠道消化过程的体外试验中也更易于溶解释出，进而被人体吸收。本研究中迁移系数最高的红壤中铅的生物可给性较高；而迁移系数最低的黑土中铅的生物可给性较低。Tessier连续提取法的步骤相对繁琐，所要消耗的时间（至少20 h）远长于体外试验（约6 h），因此体外试验方法不仅直接而准确，且非常适用于大量土壤样品的健康风险评估工作。

3 结论

（1）针对中国5种典型土壤（红壤、褐土、黑土、棕壤、黄壤）的研究，为后续开展大范围、高精度的实地铅污染土壤健康风险评估工作提供了科学依据与参考。在相同铅污染程度下（800 mg·kg−1），土壤铅在胃阶段的生物可给性为72.7%—82.6%，各类型土壤间差异极显著，其中红壤较高而黑土较低；进入小肠阶段后，因环境条件的改变，尤其是消化液pH值的急剧升高，土壤铅的生物可给性极显著降低至22.8%—27.7%，各类型土壤间无显著差异。经口部摄入的土壤铅对人体的健康风险评估结果与之相同。值得注意的是，对儿童而言，土壤铅在胃阶段的非致癌风险达到可接受限值的2.1倍；且整体而言，土壤铅对儿童的非致癌风险平均达到成人的 7.6倍，应给予重视。

（2）经口部摄入的土壤铅在胃肠道的生物可给性与土壤 pH、有机质质量分数和迁移系数分别呈高度显著负相关、高度显著负相关和高度显著正相关；其中，土壤pH是土壤铅在胃肠道的生物可给性的主导因子。通过体外试验可直接、简便而准确地获取土壤铅的生物可给性信息，建议在今后实地的污染土壤健康风险评估工作中引入该方法学。