李彬彬 姜 敏 王超然 蒋璐剑 周 琴 左明焕 姜 苗

1.北京中医药大学研究生院，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院肿瘤科，北京 100078；3.北京中医药大学生命科学学院，北京 100029

胃癌最常见的消化道肿瘤之一，近年来发病率与死亡率均呈升高趋势[1]。中医药是胃癌治疗中不可或缺的一环。中医古籍中并未提及“胃癌”的病名，现一般根据胃癌的疾病表现将其归入“积聚”“伏梁”“胃反”“癥瘕”等范畴，论其病机为“本虚标实”，即以脾胃虚弱为本，痰凝、气滞、瘀血、毒聚为标。李星等[2]通过对文献的统计分析得出胃癌证型中最常见的是瘀毒内阻证，可见“血瘀”为胃癌发生的重要因素。名老中医是国家及各省市根据临床工作与理论传承评选出的对中医药工作有重点贡献的人物，对胃癌的治疗有丰富的经验，对血瘀的治疗各有其独到的见解，但尚缺乏相关文献总结，故本文通过对文献的系统挖掘得出名老中医从瘀论治胃癌的关键药物，并以网络药理学解释活血化瘀药物作用于胃癌的主要活性成分及作用靶点。

1 资料与方法

1.1 数据采集

计算机检索2000 年1 月1 日—2019 年10 月1 日内中国知网（CNKI）、万方数据知识服务平台（Wanfang Data）、维普中文期刊服务平台（VIP）数据库，结合人工检索相关书籍。以2015 年版《胃癌临床实践指南》[3]及《中国药典》[4]为标准纳入病例并收集名老中医从论治胃癌的处方。将处方药物录入并上传至古今医案云平台（V1.5.6），在“中药配伍”的“关联分析”中得到相关关联规则结果。应用“复杂网络图分析”功能，调节“边权重”为12，得出核心药物组合。

1.2 网络药理学机制及关键干预靶点预测

1.2.1 核心药物活性化合物及对应靶点的筛选 在中药系统药理学分析数据库和平台（TCMSP）中以所得核心药物为关键词，并按照口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 筛选化合物。此外，在TCMSP 获得筛选所得的化学成分对应的靶点蛋白，导入Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/），限定物种为人，将所有靶基因名称校正为其官方名称，剔除无对应靶点成分及重复靶点。

1.2.2 疾病靶点的确定及交集靶点的收集 在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）及在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）数据库（https://omim.org/）中通过检索关键词“gastric cancer”，收集胃癌相关靶点，利用韦恩（Venn）图显示药物靶点与疾病靶点的交集靶点。

1.2.3 网络构建和分析 将交集靶点导入String 数据库（https//string-db.org/）绘制蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。利用R 软件（Version 3.6.1）得到PPI 可视化图形，根据度值（degree）＞30 筛选核心靶点，建立“中药成分-核心靶点”数据集，并将其导入Cytoscape 3.7.2 建立网络图。

1.2.4 靶点的分子功能/生物过程和通路富集分析 在R 软件中安装相关软件包，以P ＜0.05、Q ＜0.05 进行关键靶基因基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析，并将结果以条形图和气泡图形式输出。

2 结果

2.1 药物关联度分析

共纳入68 首处方，38 种药物，挖掘得到6 条关联规则。见表1。

表1 药物关联规则

2.2 复杂网络分析

复杂网络图分析得出核心活血化瘀药物组合为当归、石见穿、丹参、莪术、延胡索、桃仁、三棱、红花。见图1。

图1 核心活血化瘀药物组合

2.3 网络药理学分析

2.3.1 中药化合物筛选及对应靶点收集 共收集到8 味核心药物所含化合物171 个，经去重、删除无靶点化合物后共得到131 个有效化合物，对应123 个靶点。其中，对应靶点数≥10 的化合物31 个。见表2。

2.3.2 疾病靶点与交集靶点收集 检索GeneCards 及OMIM 得到与胃癌对应的靶点1254 个，将药物对应靶点与胃癌对应的123 个疾病靶点进行匹配分析，得到62 个核心药物有效作用靶点，应用Venn 图见图2。

表2 核心药物主要化合物信息

图2 交集靶点Venn 图

2.3.3 PPI 网络图构建及可视化分析 将交集靶点导入String 数据库得到PPI 网络图，见图3。对网络图进行可视化分析，筛选出16 个核心作用靶点，见图4，分别是EGFR、MYC、CASP3、CCND1、ESR1、ALB、IL6、MAPK8、VEGFA、ERBB2、FOS、AR、MDM2、CYCS、CASP8、RELA，提示这些核心作用靶点在网络中起到关键作用。

2.3.4 网络特征分析 经上述可得核心药物对胃癌的16 个核心有效靶点，对应52 个中药成分，见图5。网络中连接度前6 的中药成分为槲皮素、木犀草素、黄芩素、β-胡萝卜素、山奈酚和丹参酮ⅡA。

2.3.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 通过关键靶基因，共富集1327 个生物学过程和功能，根据校正后P 值进行排序，选择生物过程、分子功能及细胞成分前10 个进行条形图展示，见图6（封四），共富集38 条通路，根据校正后P 值进行排序，选择前20 个进行气泡图展示，见图7（封四）。

图3 交集靶点蛋白-蛋白互作网络图

图4 核心靶点可视化分析

图5 “中药成分-核心靶点”网络

3 讨论

在胃癌的发生发展过程中，血瘀证贯穿始终，叶天士曾指出“久病入络”“久病必有瘀”，王捷虹课题组[5]通过跟踪324 例胃癌前病变患者2 年，得出“毒瘀交阻”是其发生癌变的核心病机，解毒化瘀兼益气养阴法能有效阻止其癌变。名老中医陈光伟认为中晚期胃癌多为虚实夹杂，而实邪主要有热、瘀、毒、痰[6]。名老中医刘沈林认为胃癌晚期治疗以健脾养正消癥法为主，选方可参照健脾资生丸合血癥丸[7]。故在胃癌治疗的不同时期均可应用活血化瘀药物。

本研究得出名老中医治疗胃癌血瘀证的核心药物为当归、石见穿、丹参、莪术、延胡索、桃仁、三棱、红花。关联规则分析可得关联度较强的药对组合有三棱-莪术、红花-桃仁。研究发现[8-9]，红花-桃仁药对可改善胃癌血瘀证患者的凝血指标，降低血液黏度。张莹等[10]发现三棱、莪术组方可通过降低胃癌移植瘤裸鼠血清环氧合酶-2（COX-2）和血管内皮生长因子（VEGF）水平，从而达到抑制肿瘤生长的作用。石见穿、丹参与当归均对肿瘤细胞有抑制作用[11-13]。

网络药理学分析可得活血化瘀核心药物主要活性成分有槲皮素、木犀草素和黄芩素等。GO 功能分析集中在类固醇激素反应、对有毒物质的反应、细胞核受体活性等方面。槲皮素可调节组蛋白乙酰化，进而影响基因转录，同时FOS、AHR、JUN 等可能是槲皮素在胃癌中的作用靶点[14]。而山奈酚可通过上调miR-181a、抑制多种通路来抑制胃癌SNU-216 细胞的活力和增殖，促进细胞自噬[15]。提示核心药物的几种主要成分可能通过调节细胞核内miRNAs 及核外多种蛋白酶来影响一系列通路，主要通路有PI3K-Akt 信号通路、细胞凋亡、MAPK 信号通路、HIF-1 信号通路等。细胞凋亡与Bcl-2 家族蛋白和caspase 家族蛋白密切相关，同时与PI3K-Akt 信号通路及MAPK 信号通路等多条通路有关[16]。PI3K-Akt 信号通路是影响细胞周期的重要通路，PI3K 和Akt 蛋白的磷酸化可激活MTOR通路，从而促使肿瘤细胞从G0/G1期向S 期进展[17]。MAPK 包括多种信号途径，其中JNK、p38 MAPK 与细胞凋亡密切相关[18]。实验证明，核心药物所含木犀草素[19]、黄芩素[20]与山奈酚[15]均可通过PI3K-Akt 信号通路或者MAPK 信号通路诱导细胞凋亡。实体肿瘤的迅速生长使中心区域氧气供应不足，激活HIF-1，VEGF 被认为是HIF-1 的下游基因，可促进胃癌血管生成，与肿瘤复发转移有关。所以推测核心药物可以通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管新生来控制胃癌细胞生长转移。PI3K-Akt 信号通路与HIF-1 通路也与化疗和靶向药物的耐药有关[21]。实验证明，黄芩素可能通过HIF-1α 通路下调药物外排功能，从而逆转缺氧诱导的胃癌5-FU 耐药。β-胡萝卜素是一种常见的抗氧化物，存在于多种果蔬及药物之中。研究表明，β-胡萝卜素对幽门螺杆菌感染的胃癌高危人群具有保护性作用[23]。丹参酮ⅡA 可以抑制细胞增殖和肿瘤生长，增强阿霉素对耐药胃癌细胞的抗癌作用[24-25]。由以上分析，可推测核心药物通过多种成分从不同通路影响细胞周期，促进细胞凋亡，逆转化疗耐药，影响血管生成等，体现了中药多成分、多靶点、多途径的整体调节特点。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对名老中医治疗胃癌血瘀证的核心药物的作用机制进行探讨，结果显示核心活血化瘀药物的主要潜在活性成分及作用靶基因与胃癌作用通路的关系，为进一步深入探讨其作用机制提供新思路，但仍需进一步的实验研究进行验证。