范晨阳 马 璇,2 季志红 李柯翱 李治建

1.新疆奇沐医药研究院（有限公司）研发部，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011 3.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所毒理学研究室，新疆乌鲁木齐 830049

自2019 年12 月新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）发生以来，全球感染人数不断增加，国家卫生健康委员会发布的《关于印发新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》，从第3 版到第7 版均推荐使用中医药[1-2]。不同地区根据各地特点制订了适合的防治方案[3]。新疆也制订了相应的中医药防治方案，其中《新疆维吾尔自治区新型冠状病毒感染的肺炎维吾尔医诊疗专家共识》指出如属于湿热的血液质腐浊型患者，推荐使用祖卡木颗粒[4-5]，已报道的文献显示祖卡木颗粒具有抗病毒与抗炎的作用[6]，对于感冒引起的咳嗽、发热无汗、咽喉肿痛、鼻塞流涕等症具有显著的疗效[7]。

本研究运用网络药理学分析技术探究祖卡木颗粒中山柰、睡莲花、薄荷等十味药材的活性成分及其参与治疗COVID-19 的物质基础与作用机制，运用分子对接技术探索其分子生物学方面潜在的作用机制。

新型冠状病毒3CL 水解酶（SARS-CoV-2 3CL 水解酶）是冠状病毒的主要蛋白之一，在病毒的增殖过程中发挥重要作用，其基因具有高度的保守性，被作为药物设计的关键靶点[8-10]。血管紧张素转化酶Ⅱ（ACE2）受体结合域是COVID-19 S 蛋白与ACE2 受体结合的关键结构，其与ACE2 的亲和力与病毒传播速度有关。两者结合可激活宿主免疫系统，从而启动“炎症风暴”，本研究从阻断炎症风暴，干预病情进展的角度[11]，选取SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 蛋白作为受体蛋白进行分子对接研究。

1 方法

1.1 祖卡木颗粒中活性成分筛选与靶点蛋白搜集

利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），在“Herb name”检 索栏，分别以“山柰”“薄荷”“大枣”“甘草”“大黄”“罂粟壳”为关键词检索，获取各味药材化学成分。在中国知网以2000 年1 月1 日—2020 年4 月1 日为检索时限，分别以“睡莲花”“洋甘菊”“破布木果”“蜀葵子”为关键词检索文章，获取各味药材所含的化学物质。以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为条件，分析筛选祖卡木颗粒的活性成分。利用TCMSP数据库中的靶点预测功能，搜索祖卡木颗粒中活性成分主要作用的靶点，运用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/），通过导入蛋白名称并限定物种为“Homo sapiens”，将检索得到的所有蛋白靶点校正为Uniprot ID，并得到靶点蛋白所对应的基因。

1.2 祖卡木颗粒药材-成分-靶点网络的构建

将“1.1”项筛选的祖卡木颗粒中活性成分及其作用靶点基因名导入Cytoscape3.7.2 软件，以此构建“药材-成分-靶点”网络。对祖卡木颗粒中每个药材所含活性成分及其调控靶点进行可视化分析。

1.3 COVID-19 靶点的收集及潜在靶点预测

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）gene 数据库，输入关键词为“Novel coronavirus”，选择“Homo sapiens”为物种，得到COVID-19 相关基因。在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/），输入关键词为“Novel coronavirus”，检索COVID-19 相关基因，使用Venny 2.1.0 软件，将祖卡木颗粒的靶点与COVID-19的靶点进行映射，获取祖卡木颗粒治疗COVID-19 的潜在靶点。

1.4 蛋白相互作用网络（PPI）及药物-成分-靶点-疾病网络

将“1.3”项获得的靶点导入STRING 数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl），以此构建潜在靶点蛋白相互作用网络（PPI），通过Cytoscape3.7.2 软件，构建药物-成分-靶点-疾病网络，对祖卡木颗粒治疗COVID-19 的成分与靶点进行可视化分析，选取度值最大的9 个成分作为核心成分。

1.5 潜在靶点通路富集分析

为进一步观察潜在靶点的生物学功能，使用Bioconductor 生物信息软件包，利用Rx64 3.6.2 进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，并绘制成柱状图和气泡图。将潜在靶点与KEGG 信号通路导入Cytoscape3.7.2软件，进行基因-通路网络分析，筛选出关键靶点与显著富集的信号通路并进行可视化。

1.6 核心成分-靶点分子对接

将“1.4”项下获得的祖卡木颗粒核心成分分别与SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 蛋白进行分子对接，分析其潜在结合位点。先从RSCBPDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）下载SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 的3D 结构pdb 格式文件，用Mgltools1.5.6处理，通过加氢，计算电荷，合并非极性氢后保存成pdbqt 文件。在TCMSP 平台下载核心成分的3D 结构，然后用Mgltools1.5.6 处理，通过加氢，计算电荷，合并非极性氢后保存成pdbqt 文件。分别将SARSCoV-2 3CL 结构原配体位置、ACE2 全局位点作为结合位点，设置Grid Box 坐标和盒子大小，运用Autodock vina.1.1.2 进行分子对接，PyMol 2.3.0 进行构象的处理。

2 结果

2.1 祖卡木颗粒中活性成分及其潜在靶点

通过“1.1”项研究，共获得祖卡木颗粒中746 个化合物，再以OB≥30%和DL≥0.18 为筛选条件，剔除不符合条件的成分，筛选出祖卡木颗粒中活性成分166 个，去掉重复后共获得125 个活性成分。通过TCMSP 平台检索125 个活性成分的潜在靶点，借助Uniprot 数据库对靶点及其对应的基因进行搜集与记录，最终获得祖卡木颗粒125 个活性成分和252 个靶点。

2.2 祖卡木颗粒药材-成分-靶点网络

通过“1.2”项研究绘制出药材-成分-靶点网络，网络包含377 个节点和2067 条边，见图1。其中9 个共有成分，MOL000096（儿茶素）来自于大黄和大枣，MOL000098（槲皮素）来自于大枣、甘草、睡莲花和蜀葵子，MOL000211（丁子香萜）来自于大枣和甘草，MOL000358（β-谷甾醇）来自于大黄、大枣、破布木果，MOL000359（谷甾醇）来自于薄荷和甘草，MOL000422（山柰酚）来自于甘草、山柰和蜀葵子，MOL000471（芦荟大黄素）来自于薄荷和大黄，MOL000787（延胡索碱）来自于大枣和罂粟壳、MOL004328（柚皮素）来自于薄荷和甘草。

图1 祖卡木颗粒药材-成分-靶点网络

2.3 祖卡木颗粒治疗COVID-19 潜在靶点预测

通过“1.3”项研究，运用NCBI 和GeneCards 数据库进行检索，分别得到COVID-19 的潜在靶点48 个和350 个，去掉重复后，最终得到COVID-19 相关靶点352 个。运用Venny 2.1.0 将祖卡木颗粒活性成分调控的252 个靶点与COVID-19 的352 个靶点取交集，得到50 个交集靶点，见图2。

图2 祖卡木颗粒治疗COVID-19 靶点韦恩图

2.4 祖卡木颗粒治疗COVID-19 的PPI 网络

将“2.3”项下获得的50 个交集靶点基因导入到STRING 数据库，得到潜在靶点的PPI 网络见图3，PPI 网络包含50 个节点和654 条边，其中八边形节点表示靶点蛋白，度值表示节点的重要性，其中靶点节点度值中位数为28，平均节点度值为26.2，超过平均度值的靶点有27 个。

2.5 祖卡木颗粒药材-成分-靶点-疾病网络

寻找“2.3”项下获得的50 个交集靶点基因在祖卡木颗粒中对应的活性成分，共得到50 个基因的114 个活性成分。将其导入Cytoscape3.7.2 中，得到祖卡木颗粒药材-成分-靶点-疾病网络图4，网络包含164 个节点和501 条边。圆形代表基因，三角形代表活性成分。选取度值最大的成分和基因作为核心成分与核心基因，由图4 可见，核心基因有GTPS2、PPARG、MAPK14、NOS2、GTPS1 和DPP4 等，核心成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、金合欢素、甘草查尔酮、芦荟大黄素、异鼠李糖和β-谷甾醇等。

图3 祖卡木颗粒与COVID-19 交集靶点的PPI 网络

2.6 潜在靶点通路分析

借助R 语言对“2.3”项下获得的50 个交集靶点基因进行GO 富集分析，1876 项被显著富集（P ≤0.05），其中生物过程1754 项，细胞组成33 项，分子功能89 项，前20 项显著富集的生物过程、细胞组成和分子功能结果见图5（封三）。

图4 祖卡木颗粒药材-成分-靶点-疾病网络图

图5 祖卡木颗粒潜在靶点的GO 富集分析的前20 个通路（见内文第12 页）

GO 富集分析主要集中在生物过程中，显著富集主要涉及对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、细胞对生物刺激的反应（cellular response to biotic stimulus）等；细胞组成显著富集主要涉及脂膜筏（membrane raft）、脂膜微结构域（membrane microdomain）和脂膜区（membrane region）；分子功能显著富集主要涉及细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）等。

对“2.3”项下获得的50 个交集靶点基因进行KEGG 通路富集分析，155 条信号通路（P ≤0.05）显著富集，前20 条显著富集信号通路结果见图6（封三）。显著富集的通路涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（Hepatitis B）等。

图6 祖卡木颗粒潜在靶点KEGG 富集分析的前20 条通路（见内文第12 页）

2.7 基因-通路网络分析

将“2.3”项下获得的50 个交集靶点基因与“2.6”项下获得的KEGG 通路导入Cytoscape3.7.2 中，选取betweenness centrality（BC）大于中位数的节点，可视化得到祖卡木颗粒治疗COVID-19 基因-通路网络见图7。内圈圆形代表基因，外圈圆形代表通路。网络图显示MAPK1 的BC 最大，是调控信号通路的核心基因，其他几个基因也有较大的BC，如MAPK3、RELA、MAPK8 等。他们可能是祖卡木颗粒治疗COVID-19的主要基因。

2.8 分子对接

祖卡木颗粒中核心成分与SARS-CoV-23CL 水解酶和ACE2 结合能均＜-5.0 kJ/mol。由此可见祖卡木颗粒中的核心成分与SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 形成构象能量低，结构稳定，结合活性较高，可能是祖卡木颗粒治疗COVID-19 的主要成分。见表1。

槲皮素、山柰酚、木犀草素与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2 构象见图8。由图可见，槲皮素与SARS-CoV-2 3CL 水解酶的结合位点为SER-144，LEU-141、ARG-188、CYS-145、HIS-163，山柰酚与SARS-CoV-2 3CL 水解酶的结合位点为ASP-187、TYR-54、SER-144，木犀草素与SARS-CoV-2 3C 水解酶的结合位点为GLY-143、HIS-163、SER-144、CYS-145；槲皮素与ACE2 结合位点为GLU-406、ARG-518、GLU-402、HIS-374，山柰酚与ACE2 结合位点为GLU-402、ARG-518、HIS-374、HIS-345，木犀草素与ACE2 结合位点为GLU-406、ASN-277。

3 讨论

分子对接结果显示槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、金合欢素、甘草查尔酮和芦荟大黄素等成分可能是祖卡木颗粒治疗COVID-19 的潜在物质基础。研究发现，槲皮素具有抗病毒、抗炎和免疫调节等药理作用[12]，可能参与基于白细胞介素（IL）-6、IL-1β 调控的NF-κB 信号通路（hsa04064）对支气管炎起到治疗作用[13]，参与CASP3 调控的细胞凋亡信号通路（hsa04210）发挥抗病毒作用[14]，这与本研究“2.7”项下结果一致。山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗骨关节炎和免疫调节等多种药理活性[15]，是祖卡木颗粒质量控制主要成分之一，山柰、蜀葵子和甘草药材中均含有山柰酚成分，其通过IL-6 等炎症因子参与机体对抗急性和慢性炎症[16-17]。木犀草素和柚皮素具有抗病毒、抗炎等作用[18-19]。金合欢素与糖分子结合形成的黄酮苷类化合物金合欢素-7-O-葡萄糖苷通过肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和VCAM-1 调控NF-κB的激活[20-22]。甘草查耳酮通过抑制一氧化氮合成和IL-6 的产生从而调控NF-κB 信号通路发挥抗炎、抗氧化和免疫调节作用[23]。芦荟大黄素具有阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤细胞转移作用，是一种重要的抗肿瘤药物[24-25]。综上所述，祖卡木颗粒中筛选出的活性成分主要有抗病毒、抗炎、免疫调节及抗肿瘤等作用，可能在治疗COVID-19 时发挥抗病毒、抗炎及免疫调节的作用。

图7 祖卡木颗粒治疗COVID-19 基因-通路网络

表1 祖卡木颗粒中核心成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2 的结合能（kJ/mol）

基因-通路网络分析显示，MAPK3、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA、IL-6、TP53、MAPK14 和IL1B 是富集比较显著的基因，其中丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）在病毒感染的环境应激下被激活，MAPK3，MAPK1 和MAPK8 对细胞炎症反应和肿瘤细胞的增殖、分化、转化和凋亡的调控均有显著影响[26-27]。RELA以一种弱的结合方式结合在NF-κB 复合物中，可以直接参与DNA 结合，除了可以直接激发转录激活剂的活性外，它还能够调节启动子对转录因子的可及性，从而间接调节基因表达；通过与DDX1 的结合与NFκB 启动子区的染色质结合，对T 细胞中细胞因子基因表达至关重要[28]。NF-κB 同二聚体RELA-RELA 复合物可能参与了侵袭素介导的IL-8 表达激活。PRKCB 通过调节BCR 诱导的NF-κB 活化在B 细胞活化中起关键作用。通过直接磷酸化SER-559、SERr-644 和SER-652 处的CARD11/CARMA1，介导NF-κB 途径（NF-κB1）的激活[29]。文献报道动态观察IL-6 水平有助于了解感染性疾病的进展和对治疗的反应，IL-6 水平在正常组与治疗组的水平规律为正常组＜轻症组＜重症组，在发布的《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第七版）》中，IL-6 已经被定为病情恶化的临床警示指标[30-32]。祖卡木颗粒50 个潜在靶点主要涉及病毒感染、炎症反应、免疫调节等方面。

在前20 条显著富集的KEGG 信号通路中，与病毒感染相关的有12 条，分别为甲型流感、百日咳、利什曼病、乙型肝炎、丙型肝炎、肺结核、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、麻疹、人类免疫缺陷病毒-1 感染、人乳头瘤病毒感染和Epstein-Barr 病毒感染，这预示着祖卡木颗粒在抗病毒中发挥重要的作用。

图8 槲皮素、山柰酚、木犀草素与SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2 的分子对接模式