李清丰，杨成迎，杨锦涛，支霄刚，周天英

（1.隆昌市农业农村局，四川 隆昌 642150；2.西南大学荣昌校区动物科学院，重庆 402460；3.北京伟嘉饲料集团，北京 100089；4.隆昌市农业农村局，四川 隆昌 642150）

仔猪断奶时可能导致肠道形态改变以及功能受损。大肠杆菌产肠毒素可导致仔猪断奶生长产性能降低，病死率升高[1]。抗生素的滥用导致药物在畜产品中法人残留，并产生多重耐药性。因此，寻找安全的抗生素替代品成为亟待解决的难题。研究表明，日粮中添加乳杆菌和ZnO可显著改善断奶仔猪的生长性能及健康状况[2-3]。锌属于重金属，易在土壤中累积，因此，短期内锌在断奶仔猪日粮中的添加量应≤3 000 mg/kg[4]。目前，日粮中同时添加ZnO和益生菌对断奶仔猪的影响机制尚不明确。本研究旨在探究嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LA）和ZnO 对断奶仔猪的生长性能以及对口服大肠杆菌K88 仔猪空肠形态和免疫功能的影响，为LA 和ZnO 在断奶仔猪养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

ZnO、LA 均购自南京邦诺生物科技有限公司，嗜酸乳杆菌活菌量约为5×1010CFU/g。

反转录试剂盒（Takara 公司）、荧光定量PCR 试剂盒（Thermo Fisher Scientific）、荧光定量PCR 仪器（7900HT，ABI公司）、ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 试验设计

试验于重庆市某规模化养殖场进行。选取平均体重为（7.24±0.21）kg 的28 日龄三元杂交断奶仔猪120 头，随机分为4组，每组6个重复，每个重复5头猪。采用2×2试验设计，包括2 水平的LA（0、4×1010CFU/kg）及2 水平的ZnO（0、0.1%）。日粮中未添加LA 和ZnO 为对照组，仅添加LA、ZnO 的组分别为LA 组和ZnO 组，同时添加LA 和ZnO组为LA×ZnO组。试验期30 d，期间仔猪自由采食和饮水，基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）Tab.1 Basal diet composition and nutritional level(air-dry basis)

1.3 样品采集

试验第30 d，8：00对仔猪进行称重。每个重复挑选一头与平均体重接近的仔猪，灌服1×1010CFU/mL大肠杆菌K88 稀释液10 mL；对照组每个重复中挑选1 头仔猪为空白对照组，灌服等体积的生理盐水。6 h后注射戊巴比妥，解剖仔猪，沿肠系膜附件纵向切开3 cm 的上行空肠段，0.9%NaCl溶液冲洗，10%中性福尔马林固定，采集约10 g空肠样本，液氮冷冻，-80 ℃保存。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能

试验第0 d 和第30 d 时称量所有仔猪的体重，记录饲料消耗情况，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）以及料重比（F/G）。

1.4.2 空肠形态

截取约5 μm固定的空肠样本，石蜡包埋，使用苏木精和伊红亚甲蓝染色进行组织学分析。每张切片随机选择10个绒毛及相应隐窝，显微镜观察黏膜结构，利用Motic软件测量绒毛高度（VH）、绒毛宽度（VW）以及隐窝深度（CD），计算绒毛高度和隐窝深度比（VH/CD）。

1.4.3 免疫功能

采用TRIzol法提取冷冻空肠样本总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录，进行实时荧光定量PCR，检测黏蛋白2（MUC2）和β 防御素3（DEFB3）的mRNA 表达量。以βactin 为内参，采用2-ΔΔCt 法对实时定量PCR 数据进行分析。检测猪空肠中免疫球蛋白A（IgA）的含量。试验操作均按照试剂盒说明书进行，试验所用引物序列见表2。

表2 引物序列Tab.2 Primersequences

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2019 软件对数据进行初步整理，采用SAS 9.2软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Tukey's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 LA和ZnO对仔猪生长性能的影响（见表3）

由表3 可知，与对照组相比，LA 组、LA×ZnO 组的仔猪ADG 均显著升高（P＜0.05）；ZnO 组的仔猪ADG 有升高趋势，但差异不显著（P＞0.05）；LA 组、ZnO 组以及LA×ZnO组仔猪料重比均显著降低（P＜0.05）。

表3 LA和ZnO对仔猪生长性能的影响（n=30）Tab.3 Effect of LA and ZnO on the growth performance of piglets(n=30)

LA和ZnO对仔猪生长性能的影响无显著的交互作用（P＞0.05）。

2.2 LA和ZnO对仔猪空肠形态的影响（见表4）

由表4可知，与空白对照组相比，对照组空肠VH、VW及VH/CD 均 显 著 降 低（P＜0.05），空 肠CD 显 著 升 高（P＜0.05）。与对照组相比，LA、LA×ZnO 组仔猪的空肠VH、VW 以及VH/CD 均显著升高（P＜0.05），CD 显著降低（P＜0.05）；ZnO组仔猪空肠VH/CD显著升高（P＜0.05）。但LA 与ZnO 对断奶仔猪的空肠形态无显著的交互作用（P＞0.05）。

表4 LA和ZnO对仔猪空肠形态的影响（n=6）Tab.4 Effect of LA and ZnO on the morphometric characteristics of the jejunal mucosa of piglets(n=6)

2.3 LA和ZnO对仔猪免疫功能的影响（见表5）

由表5 可知，对照组仔猪空肠中MUC2、DEFB3 mRNA 相对表达量及IgA 含量均显著低于空白对照组（P＜0.05）。与对照组相比，LA 处理组、ZnO 处理组、LA×ZnO处理组均仔猪空肠中MUC2和DEFB3 mRNA表达量均极显著提高（P＜0.01），LA处理组空肠组织中IgA的含量显著增加（P＜0.05）。LA和ZnO对空肠中基因表达和IgA含量的影响无显著交互作用（P＞0.05）。

表5 LA和ZnO对仔猪免疫功能的影响（n=6）Tab.5 Effect of LA and ZnO supplementation on the immune function of piglets(n=6)

3 讨论

3.1 LA和ZnO对仔猪生长性能的影响

断奶应激损害仔猪肠道黏膜屏障，增加肠道通透性，导致胃肠易发生疾病，影响生长性能。LA 通过定植于宿主肠上皮细胞，并代谢产生有机酸等物质，抑制有害菌生长，维持宿主肠道菌群平衡，促进动物的生长发育[5]。ZnO可维持肠道细胞氧化还原状态，减缓断奶仔猪肠道通透性增加，缓解肠道功能紊乱[6]，促进机体吸收利用养分。

本研究发现，日粮中添加4×1010CFU/kg 的LA 或0.1%的ZnO均可显著提高仔猪ADG，显著降低F/G。Qiao等[2]研究发现，添加乳酸杆菌或ZnO可显著提高仔猪ADFI和ADG，与本试验结果一致。因此，可推测LA 和ZnO 均具有促进断奶仔猪生长的功能，并具有减弱断奶应激的影响。

3.2 LA和ZnO对仔猪空肠形态的影响

大肠杆菌促进肠道分泌肠毒素，引起机体内电解质紊乱，导致动物腹泻，破坏肠道内部免疫防护屏障[7]。本研究发现，LA 组的仔猪空肠VH、VW 和VH/CD 显著高于对照组仔猪，CD 则显著降低；ZnO 组的断奶仔猪空肠VH/CD较对照组显著提高；LA 和ZnO 单独或同时添加均可改善大肠杆菌感染的仔猪空肠黏膜的形态学特征。

仔猪断奶期间，仔猪抵御外来病原菌最有效的物质是益生菌。乳酸杆菌通过改善肠道内部的pH 值、促进胞外多糖分泌等途径抑制病原菌生长，维持肠道内部微生物群平衡、保持肠道上皮完整，改善机体健康状况[8]。ZnO能够维持肠上皮细胞的生长发育，促进肠道内部有益菌群繁殖，维持机体免疫防护功能[6]。祁凤华等[8]研究表明，日粮中添加0.1%的LA 可显著增加肉鸡小肠VH、VH/CD。吕航[9]研究发现，日粮中添加氧化锌能够显著提高断奶仔猪空肠VH和VH/CD。上述研究结果与本试验结果类似，表明日粮中添加LA 和ZnO 可显著改善仔猪空肠形态，但两者间无显著的交互作用。

3.3 LA和ZnO对仔猪免疫功能的影响

消化道及相关免疫防御机制的发育，对优化饲养方式非常重要。黏液层由高度糖基化的黏液蛋白组成，MUC2是此类黏蛋白的一种，因此，MUC2 的合成可能是影响肠道屏障的潜在因素[10]。DEFB通过破坏病原菌的生物膜或病毒外壳蛋白消灭病原微生物，激活机体获得性免疫系统，提高机体免疫水平[11]。Liu等[12]研究发现，随着锌添加量的升高，空肠中MUC2的mRNA表达量随之增加。李云燕等[13]研究发现，经过LA 处理的小鼠肠道MUC2 表达量不断提高，表明LA 具有机体免疫调节的功能。Yoshida等[14]研究表明，仔猪口服植物乳杆菌Lq80 可提高断奶仔猪肠道中IgA 含量。本试验发现，对照组仔猪空肠中MUC2、DEFB3 的mRNA 相对表达量及IgA 含量显著低于空白对照组，表明经过大肠杆菌处理后仔猪肠道内部免疫屏障及功能可能被损害；各处理组仔猪在灌服大肠杆菌后空肠中MUC2、DEFB3的mRNA相对表达量均显著低于对照组，LA组空肠中IgA含量显著低于对照组。日粮中添加LA、ZnO影响了仔猪的免疫反应，并且能够减弱大肠杆菌K88的影响，提高仔猪的生长性能。

4 结论

日粮中添加LA 和ZnO 均可提高断奶仔猪的生长性能，且对大肠杆菌K88攻毒后的仔猪空肠发育和免疫功能具有调节作用，但LA和ZnO之间无显著的交互作用。