黄 煌 林迳苍 吕国荣 许险艳 许相洋

（泉州医学高等专科学校组织学胚胎学教研室，泉州 362000）

Barker 等[1-2]在20 世纪90年代指出，成年时期的某些疾病有可能来源于“胚胎”，例如胎儿时期氧气、营养等环境因素会影响胚胎早期发育，导致成年期的某些代谢性疾病会被程序性控制[3-5]。胰岛素样生长因子-l（insulin-like growth factor-l，IGF-1）主要在肝产生，游离的IGF-1 可以结合相应的受体，促进脂肪的合成，且抑制其分解，使游离脂肪酸溶度降低。另外IGF-1 有促进物质代谢、降低血糖、促进生长发育等生理功能。非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）镜下主要病理特征是弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性，其特征与酒精性脂肪性肝病（alcoholic fatty liver disease，AFLD）相似，但NAFLD一般无过量饮酒史。课题组前期研究表明，NAFLD发生发展的程度与IGF-l的表达水平呈负相关[6-7]，NAFLD仔鼠用高脂饮食饲养显示其肝细胞IGF-1 mRNA水平明显比正常仔鼠低[8-9]。本研究建立孕大鼠缺氧模型，观察慢性间断性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）对子代1 d龄雄仔鼠肝细胞作用及IGF-1基因组蛋白修饰和表达情况。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康SD大鼠24只，怀孕龄7d，体质量175～195 g，购自上海斯莱克公司[许可证：SCXK（沪）2007000569092]。辣根酶标记兔抗羊IgG、SP两步法试剂盒、real-time PCR试剂、免疫蛋白印迹试剂、染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation，ChIP）试剂等购自福州鼎鑫泰斯特科技有限公司；兔抗大鼠IGF-1抗体、HRP标记羊抗兔IgG二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.2 CIH 模型制备及动物分组

SD 孕大鼠24 只随机分为对照组和缺氧组，每组12只。对照组于40%～70%相对湿度，温度18℃～25℃塑料笼（带不锈钢盖）内饲养，自由摄水，自然采光；缺氧组置入缺氧箱饲养，及时调整O2、N2流量，用小风扇将箱内的空气不断地混匀，将O2浓度控制在10.0%±0.5%（对照组O2浓度为21%）。缺氧箱内、外借箱壁的小孔沟通，箱内气压与大气压平衡。每天8 h 维持这种状态，即上 午6：30—10：30、下 午15：30—19：30。重复至妊娠第21 天。待产孕鼠分笼，每只孕鼠分娩仔鼠12～13 只，分娩得到12 窝对照组仔代大鼠156 只，12 窝缺氧组仔代大鼠153只。2组孕鼠平均产仔数及胎鼠存活率、雌雄比例差异均无统计学意义。因雌激素可干扰机体脂质代谢水平[10]，故本研究采用日龄1 d 的雄仔鼠。

分娩后，随机选取对照组、缺氧组各30只日龄1 d 的雄仔鼠，麻醉处死后取肝组织标本，分别做ChIP 检测、real-time PCR、免疫蛋白印迹、电镜检查、免疫组织化学检查，每项标本各6只。

1.3 免疫组织化学检测肝组织IGF-1表达

常规石蜡标本制片，采用免疫组织化学显色检测肝组织IGF-1 蛋白表达，按试剂盒说明书操作。一抗及二抗工作浓度均为1：100。以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达，运用Image-Pro Plus 6.0型图像处理分析软件，测定切片平均光密度值（average optical density，AOD）。

1.4 电子显微镜观察肝组织超微结构

取2组1 d 龄的雄仔鼠肝组织，置于3%戊二醛中，放于4℃2 h 以上，用0.1 mol/L PBS（pH=7.2）漂洗，共3次；标本置于1%锇酸，4℃1.5 h，用0.1 mol/L PBS（pH=7.2）漂洗3次，乙醇脱水；经过浸透、包埋和聚合后，用超薄切片机切片，染色后水洗，电镜下观察肝组织超微结构。

1.5 Real-time PCR 检测肝组织 IGF-1 mRNA 水平

提取1 d 龄雄仔鼠肝组织，使用TRIzol 法抽提肝组织总RNA，将RNA 逆转录成cDNA，再行定量PCR 反应。根据 Genebank 的数据库（Primer 5.0）设计引物序列。IGF-1基因上游引物序列为5'-TTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTT-3'，下游引物序列为 5'-CTTCTCCTTTCTCTGTGTTG -3'；内参β-actin 上游引物序列为5'-GGCTCTCTGCTCCTC C-3'，下游引物序列为5'-CCGTTCACACCGACT T-3'。Real-time PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，54℃退火30 s，68℃延伸30 s，共 30个循环；68℃延伸 10 min；95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。采用公式2-ΔΔCT计算mRNA表达量。

1.6 免疫蛋白印迹检测IGF-1 蛋白表达水平

取2组1 d龄雄仔鼠肝组织标本，依照 RIPA说明书进行免疫蛋白印迹检测。其主要的步骤为：肝组织总蛋白提取、蛋白质变性样品与加样、分离胶和浓缩胶的配置、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶和上样、电泳、转膜、封闭、免疫反应、ECL 反应及胶片曝光、凝胶图像分析。扫描获取条带的灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比作为蛋白相对表达量。

1.7 ChIP 检测IGF-1组蛋白

ChIP 为可以快速反映蛋白质-DNA 相互作用的表观遗传学的技术。其主要步骤为：稳定蛋白质-DNA 复合物、分离核组分；超声处理使染色质片段化（长度200～1 000 bp）；使用目的蛋白特异性抗体（表1）捕获蛋白质-DNA 复合物中的目标蛋白质，抗体免疫沉淀，并从细胞核组分中分离蛋白质；解交联并且纯化 DNA，以染色质免疫沉淀所得DNA 为模板，使用IGF-1基因各位点引物用real-time PCR 法定量各组蛋白修饰的水平。选择GAPDH 序列为内参照。经检测该序列含有所有5 种共价修饰引物序列（表2）。

1.8 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。呈正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 组蛋白修饰抗体

2 结果

2.1 妊娠期缺氧动物模型的建立

缺氧组孕鼠的动脉血氧分压、氧浓度和对照组孕鼠比较明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。但缺氧组孕鼠和对照组孕鼠血液中CO2分压及pH值差异无统计学意义（P＞0.05）（表3），提示CIH模型建立成功。缺氧组孕鼠母体受缺氧应激，仅出现低氧血症。

表2 共价修饰引物序列

表3 孕鼠动脉血气分析比较（n=12，±s）

表3 孕鼠动脉血气分析比较（n=12，±s）

*P＜0.05 vs 对照组

组别 血氧分压（kPa）氧浓度（%）二氧化碳分压（kPa）pH值对照组 11.29±2.68 92.6±8.1 6.22±1.25 7.4±1.1缺氧组 7.14±2.75* 75.3±3.4* 5.90±2.17 7.3±2.5

2.2 子代1 d 龄雄仔鼠肝IGF-1 的表达

免疫组织化学检测结果显示，对照组1 d 龄雄仔鼠的肝IGF-1表达水平（3.66±0.71）高于缺氧组（1.83±0.51），IGF-1 主要表达在细胞质（图1）（P＜0.05）。

图1 对照组（A）及 缺氧组（B）1 d 龄雄仔鼠肝IGF-1 的表达，免疫组织化学显色，×100

2.3 子代1 d 龄雄仔鼠肝的超微结构

电镜下形态学显示，对照组肝超微结构无明显异常（图2A），缺氧组肝超微结构基本正常，偶尔在细胞质中出现脂肪滴（图2B）。

2.4 子代1d 雄仔鼠肝组织IGF-1 mRNA 及蛋白表达水平

Real-time PCR结果表明，对照组IGF-1 mRNA水平（0.928 873±0.012 445）高于缺氧组（0.503 444±0.010 900），差异有统计学意义（P＜0.05）。

对照组IGF-1 蛋白（1.878 47±0.038 63）表达水平显著高于缺氧组（0.903 23±0.038 32），差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.5 IGF-1基因组蛋白ChIP 测序

2.5.1 Proximal 3'UTR基因 ChIP测序结果显示（图4），对照组和缺氧组肝组织IGF-1基因Proximal 3'UTR片段H3K9me3、H3K4me3、H3k14ac、H3K36me3、H3K4me2组蛋白的修饰，差异无统计学意义（P＞0.05），但H3K9ac组蛋白修饰差异有统计学意义（P＜0.05），表明缺氧组肝组织IGF-1基因Proximal 3'UTR 片段组蛋白H3K9ac 乙酰化程度较对照组显著降低（图4）。

图2 对照组（A）及缺氧组（B）子代1 d 龄雄仔鼠肝形态结构比较，透射电镜，×4 000

图3 免疫蛋白印迹检测子代1 d 龄雄仔鼠肝组织中IGF-1 的表达（n=3）

图4 1 d 龄雄仔鼠肝IGF-1基因Proximal 3'UTR 片段组蛋白修饰对比图

2.5.2 P1基因 ChIP测序结果显示（图5），对照组和缺氧组肝组织IGF-1基因P1片段的组蛋白H3K14ac、H3K9ac、H3K4me2、H3K36me3、H3K9me3、H3K4me3修饰差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5.3 P2基因 ChIP测序结果显示（图6），对照组和缺氧组肝组织IGF-1基因P2片段组蛋白H3K14ac、H3K9ac、H3K4me2、H3K36me3、H3K9me3、H3K4me3修饰差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 1 d 龄雄仔鼠肝组织IGF-1基因P1 片段组蛋白修饰对比图

图6 1 d 龄雄仔鼠肝组织IGF-1基因P2 片段组蛋白修饰对比图

2.5.4 Exon 5基因 ChIP测序结果显示（图7），对照组和缺氧组肝组织IGF-1基因Exon 5片段的H3K36me3、H3K14ac、H3K4me3、H3K4me2、H3K9me3组蛋白修饰差异无统计学意义（P＞ 0.05），但H3K9avs位点组蛋白修饰差异有统计学意义（P＜0.05），表明缺氧组肝IGF-1基因Exon 5片段组蛋白H3K9ac乙酰化程度较对照组显著降低。

2.5.5 Distal 3'UTR基因 ChIP测序结果显示（图8），对照组和缺氧组肝组织IGF-1基因Distal 3'UTR片段 的H3K9me3、H3K36me3、H3K4me3、H3K4me2、H3K14ac组蛋白修饰差异无统计学意义（P＞0.05），但H3K9ac组蛋白修饰差异有统计学意义（P＜0.05），提示缺氧组肝IGF-1基因Distal 3'UTR片段组蛋白H3K9ac 乙酰化程度较对照组显著降低。

图7 1 d 龄雄仔鼠肝IGF-1基因Exon 5 片段组蛋白修饰对比图

图8 1 d 龄雄仔鼠肝IGF-1基因Distal 3'UTR 片段组蛋白修饰对比图

3 讨论

产前的缺氧是临床最重要、最相关的刺激，很多病理状况与宫内缺氧关系密切，如母体贫血、吸烟、胎盘功能不全、哮喘、先兆子痫等[11-12]。目前有一些学者使用动物模型进行相关的实验研究，如孕期宫内慢性缺氧等动物模型[13]。课题组前期根据母体慢性宫内缺氧和子代成年疾病有关的假说进行相关研究，取得一些研究结果[14-17]。本研究进一步采用已经成熟的动物模型[18-20]，研究CIH 对子代大鼠肝发育及IGF-1表达的影响。CIH 模型缺氧组孕鼠采用的氧浓度为10.0%±0.5%，范围和临床实践中先兆子痫、妊高症等常导致胎儿缺氧的氧浓度相互吻合，可模拟临床实践中的胎儿缺氧状况。结果显示，缺氧组的孕鼠没有出现CO2潴留、酸中毒，仅有低氧血症现象，缺氧组孕鼠仅受缺氧因素作用，说明造模成功。

课题组用 SD大鼠制作CIH动物模型，观察持续到仔鼠的成年期（5月龄），妊娠期缺氧也显著升高缺氧组雄性仔鼠甘油三酯、血清胰岛素、低密度脂蛋白胆固醇、胰岛素抵抗指数，游离脂肪酸等，与前期实验结果一致，出现大鼠机体胰岛素抵抗[18-20]。前期研究结果显示，CIH可引起胎鼠生长缓慢，伴随主要器官的生长不成比例，低出生体质量仔鼠。但缺氧组出生后出现赶超性生长，生后 20 d左右，缺氧组仔鼠体质量追赶上对照组，出现出生后缺氧组追赶性生长的现象，此现象可能是缺氧组仔鼠成年期的肝脂质大量快速沉积的原因之一[14-20]。

IGF-l 是受到表观遗传调控的可以介导调节胚胎生长发育的基因，人类IGF-1基因结构和大鼠有很高的相似度。有学者研究显示，宫内不良的环境可导致大鼠肝IGF-1 表观遗传学表现发生改变[21-22]。表观遗传学指在核苷酸序列没有发生改变时，研究基因表达的可遗传变化。对于环境变化，表型已经发生改变，但基因型没有改变，在细胞分裂过程中能保持相对稳定，并且可以随机发生。表观遗传现象已知有组蛋白共价修饰、DNA 甲基化等。染色质的最基本结构单位是核小体，其核心由H2A、H2B、H3 和H4组蛋白组成为八聚体，147 bp 的DNA 缠绕于八聚体外周。氨基末端（N端）在八聚体核心外周延伸出来，翻译后可以产生共价修饰。最重要的修饰方式有乙酰化、甲基化等，这些共价修饰可以影响染色质的构象、基因表达。组蛋白去乙酰基酶及组蛋白乙酰基转移酶可以催化组蛋白乙酰化。通常情况下，核小体组蛋白高乙酰化状态，为转录活跃区；低乙酰化为不转录活跃区[23-25]。

本研究采用ChIP 技术检测对照组和缺氧组肝IGF-1基因的组蛋白修饰，其中对于Exon 5、Proxima1 3'UTR、Distal 3'UTR、Pl、P2 片段的位点H3K9me3、H3K4me3、H3K14ac、H3K36me3、H3K4me2、H3K9ac 的组蛋白修饰进行检测。结果提示，慢性宫内缺氧导致了缺氧组肝组织IGF-1基因的Proximal 3'UTR、Exon 5、Distal 3'UTR 片段的H3K9ac组蛋白乙酰化共价修饰的水平显著降低，IGF-1 mRNA转录水平下降，IGF-1 蛋白表达水平降低。且缺氧组肝可见少量脂肪滴，提示有脂肪代谢障碍，推测发生NAFLD。

综上所述，CIH 可致缺氧组肝IGF-1基因表观遗传机制改变，可能参与宫内缺氧后雄性仔鼠非酒精性脂肪肝的发生发展过程。