王 晶，陈心怡，邓玉莹，王慧慧，谢雪晴，王春梅

(北京中医药大学 生命科学学院,北京 100029)

土鳖虫[1]为鳖蠊科昆虫地鳖(EupolyphagasinensisWalker)或冀地鳖(Steleophagaplancyi(Boleny))的雌虫干燥体[2]，味咸性寒，有小毒，归肝经，具有破血逐瘀、续筋接骨之功效。土鳖虫用于治疗骨折具有悠久的历史，最早记载于《神农本草经》。我国2015年版药典[1]中含有土鳖虫的处方共有29份，其中14份处方用于治疗跌打损伤，且药效显著。程爵棠先生编写的《虫蛇妙方》[3]中记载，土鳖虫用于治疗骨折的验方，治愈率均在70%以上，由此可见土鳖虫治疗骨折愈合临床疗效明确。土鳖虫通过对骨生长因子的调控、改善血液循环、提高成骨细胞活性等加速骨折愈合。现代研究表明，土鳖虫中含有蛋白质、氨基酸、核苷酸、脂肪酸、生物碱和脂溶性维生素等多种化学成分[4]。但是关于土鳖虫促进骨折愈合的有效成分尚不清楚，MC3T3-E1成骨细胞系是作为体外研究成骨细胞模型的成熟细胞模型[5]，因此，笔者采用多种提取方式获得土鳖虫成分，研究其对促进MC3T3-E1成骨细胞增殖活性成分的溶解性及对温度的敏感性，为后续继续深入研究土鳖虫促骨折愈合的活性成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品

土鳖虫购自安徽亳州药材市场，经北京中医药大学中药鉴定系杨瑶君教授鉴定为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphagasinensis的雌虫干燥体。

1.1.2 细胞

小鼠胚胎成骨细胞前体细胞 MC3T3-E1，由中国科学院过程工程研究所生化实验室张贵峰研究员馈赠，常规培养于含10%胎牛血清的MEM培养基中，置培养箱于5%CO2、37 ℃湿化条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.1.3 试剂

噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)，美国 Sigma公司；HyClone胎牛血清和MEM培养基，赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胰酶，美国Amresco公司；石油醚、乙酸乙酯，北京虹湖联合化工产品有限公司；无水乙醇、NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4，北京化工厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

1)土鳖虫不同温度水提物的制备。称取60 g土鳖虫粉(过0.425 mm筛)与300 mL纯水混合均匀后放入-80 ℃冰箱反复冻融5次。第5次解冻后分成3组，分别在25(室温、磁力搅拌)、50和90 ℃水浴条件下过夜，在8 000 r/min离心20 min后，上清液在真空冷冻干燥机中冻干，得到不同温度的水提物。

2)土鳖虫脂溶性成分的制备。采用索氏提取法获得脂溶性产物。参照文献[6]方法，称取土鳖虫粉5 g(过0.425 mm筛)，全部移入滤纸筒内，将滤纸筒放入脂肪抽提器内，由抽提器抽提冷凝管上端加入石油醚、乙酸乙酯于水浴上加热，使石油醚、乙酸乙酯回流提取6 h后取下接受瓶，回收石油醚、乙酸乙酯，待接受瓶内石油醚、乙酸乙酯剩1～2 mL时在水浴上蒸干后，放入干燥器内干燥冷却1 h再称质量，产物即为土鳖虫石油醚提取物和土鳖虫乙酸乙酯提取物。

3)土鳖虫的25 ℃水提物在不同温度不同时间下二次水提物的制备。取适量土鳖虫25 ℃未冻干水提物，分成5份再分别在25、37、50、75和100 ℃条件下水浴4 h，在真空冷冻干燥机中冻干，得到不同温度二次水提物；另取土鳖虫25 ℃未冻干水提物，在50 ℃水浴条件下再分别水浴4、6、8、10和12 h，在真空冷冻干燥机中冻干，得到不同时间的二次水提物。

1.2.2 MTT法检测水溶性成分对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响

参照文献[7]方法，将实验设置为阴性对照组(MEM培养基)和加药组，细胞以2×103个/孔在96孔板中培养24 h后加药，分别将各组冻干粉溶于MEM培养基中，设置不同浓度，细胞加药后24 h(48 h)后，分别加入MTT再孵育4 h后加入DMSO，检测570 nm波长处吸光值。

1.2.3 MTT法检测脂溶性成分对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响

将实验设置为阴性对照组(含1/1 000 DMSO的MEM培养基)和加药组(脂溶性产物溶于DMSO，以1/1 000比例加入MEM培养基)，细胞以2×103个/孔在96孔板中培养24 h后加药，分别将不同量的脂溶性产物DMSO 溶解液溶于MEM培养基中对应不同加药浓度，细胞加药后24 h(48 h)后，分别加入MTT再孵育4 h后加入DMSO，检测570 nm波长处吸光值OD570。

1.3 统计学分析

2 结果与讨论

2.1 土鳖虫不同提取方式产物得率

考察土鳖虫不同提取条件下所得产物的得率(产物得率=产物质量/生药总质量×100%)，结果见表1。由表1可知，水溶性成分产物得率明显高于脂溶性成分产物得率。土鳖虫不同温度水提物的得率并不随着温度的升高而升高，其中在50 ℃条件下提取的水提物得率最高为11.40%，土鳖虫不同温度的二次水提物与不同时间的二次水提物得率相差不大。

表1 土鳖虫不同提取方式产物得率Table 1 Product yield of different extraction methods of

2.2 土鳖虫水提物和脂溶性成分对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响

图1为土鳖虫水提物和脂溶性成分对成骨细胞增殖活性的影响。由图1可知：土鳖虫的25 ℃水提物在加药24和48 h后，各浓度均对成骨细胞有促增殖的作用，且具有时间浓度依赖性关系；在生药量为2 mg/mL加药后48 h时，促增殖率达到最大值为39.8%(P<0.001);土鳖虫的石油醚提取物在加药后24和48 h，各浓度对成骨细胞生长均有抑制作用，但与阴性对照组相比无显著性差异(P>0.05)；土鳖虫乙酸乙酯提取物在加药后24和48 h，各浓度均对成骨细胞生长有抑制作用，生药量为0.1 mg/mL时加药后48 h，抑制率达到最大值为22.19%(P<0.001)。

与阴性对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001图1 土鳖虫的水提物和脂溶性成分对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响Fig.1 Effects of water-soluble components and fat-soluble components of E.sinensis on theproliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.3 土鳖虫不同温度水提物对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响

土鳖虫在不同温度条件下提取的水提物作用于MC3T3-E1成骨细胞产生不同的药效，结果见图2。由图2可知：25 ℃水提物在加药后24 h，不同给药量对成骨细胞均有促增殖效果；50和90 ℃水提物对成骨细胞生长的影响与阴性对照相比均无显著性差异。这可能是样品提取过程用时较长，50和90 ℃的水提物在提取过程中长时间受热，有效成分失活。

图2 土鳖虫不同温度水提物对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响Fig.2 Effects of water extracts of different temperature ofE.sinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.4 土鳖虫不同温度二次水提物对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响

为了进一步研究土鳖虫中促成骨细胞增殖的有效成分的最大耐热温度，继续用未冻干的25 ℃水提物在不同温度条件下再次水浴4 h，结果见图3。

由图3可知：土鳖虫的25、37和50 ℃二次水提物在生药量为0.5～2.0 mg/mL时,加药后24 h对成骨细胞有促进增殖的作用，与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)；75 ℃二次水提物对成骨细胞的生长有抑制作用，但与阴性对照组相比无显著性差异(P>0.05)；100 ℃二次水提物在生药量为0.5～2.0 mg/mL时对成骨细胞生长有抑制作用，与阴性对照组相比有统计学差异(P<0.05)。因此，有效成分在50 ℃条件下对成骨细胞生长依然有促增殖的作用，但在75及100 ℃高温处理后，对成骨细胞生长不仅没有促增殖的作用，反而对成骨细胞生长有显著的抑制作用，因此推测土鳖虫有效成分最大耐热温度为50 ℃。

图3 土鳖虫不同温度二次水提物对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响Fig.3 Effect of secondary water extracts of different temperature of E.sinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.5 土鳖虫不同时间二次水提物对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响

为了继续探究土鳖虫中促成骨细胞增殖的有效成分的最大耐热时间，选取50 ℃为最大耐热温度，在其保温4 h基础上继续延长加热时间，结果见图4。由图4可知:土鳖虫在4、6和8 h时的二次水提物在生药量为1～2 mg/mL时，对成骨细胞生长有促增殖的作用(P<0.05)；10 h时的二次水提物在生药量为1.5～2 mg/mL时对成骨细胞生长有促增殖的作用，与阴性对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；12 h时的二次水提物在生药量为0.01～1.5 mg/mL时对成骨细胞生长有抑制作用，与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)。因此，加热时间延长到10 h时，部分浓度对成骨细胞生长依然有促增殖作用，但加热时间延长到12 h后，促增殖活性消失，推测50 ℃时土鳖虫有效成分最长耐热时间为10 h。

图4 土鳖虫不同时间二次水提物对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响Fig.4 Effects of secondary water extracts of different time of Eupolyphagasinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.6 讨论

土鳖虫是一类含有氨基酸、蛋白质、脂肪酸、生物碱及微量元素等多种生物活性成分的传统中药材，具有抗肿瘤、抗凝血、促进骨折愈合及调节血脂等十分广泛的药理作用[8-9]。相对于土鳖虫广泛的药理作用而言，其有效活性成分的研究才刚刚起步，初步研究认为土鳖虫的脂溶性成分中脂肪酸与抑制肿瘤生长有关[10-11]，水溶性成分中核苷类化合物有镇静作用[12]，总生物碱有扩张血管作用[13-15]，纯化得到的蛋白单体有纤溶活性[16-17]和抗肿瘤活性[18-19]。

在土鳖虫促进骨折愈合的研究中，未明确活性成分，目前多以土鳖虫粗提物进行药理活性研究。罗佩强[20]研究发现土鳖虫粉饲喂骨折家兔，可促进家兔血管形成，增加成骨细胞数量和活性，加速钙盐沉积。张立国等[21]研究证实，地鳖虫50%水提物可修复骨细胞活性，增加成骨细胞的数量，加速钙盐沉积，从而加速骨折愈合。用土鳖虫灌胃雄性SD大鼠，制备的含药血清可促进成骨细胞相关基因cbfa1的表达[22]，从而加速骨折愈合。本课题组前期利用土鳖虫50%醇提物作用于MC3T3-E1成骨细胞，对成骨细胞有促进作用[23]，并且此活性与本实验室利用动物模型进行的体内实验研究结果的相关性较好。因此，使用MC3T3-E1成骨细胞作为土鳖虫不同提取成分促增殖的活性评价指标，比较土鳖虫中水溶性成分与脂溶性成分对成骨细胞增殖的作用效果。

3 结论

土鳖虫作为传统中药，制备时不仅要以得率为参考指标，更要考虑总药效。本研究通过不同方法提取有效成分，利用MTT法比较了各组成分的生物活性。结果显示，土鳖虫中水溶性成分具有促MC3T3-E1成骨细胞增殖作用，脂溶性成分无此作用。土鳖虫25 ℃水提物中有效成分最大耐热温度和最长耐热时间分别为50 ℃、10 h。土鳖虫水溶性成分中促成骨细胞增殖的具体有效成分仍待深入探讨。