李 扬 王 云 李 遵 朱朝阳

河南大学淮河医院泌尿外科，河南省开封市 475000

膀胱癌是临床泌尿外科最常见的肿瘤之一，给患者的生命造成很大的威胁。世界上每年新发膀胱癌病例约200 000例，在美国，膀胱癌发病率居于常见恶性肿瘤的第4位，而女性膀胱癌患者的发病率约为男性患病率的25%[1]。在中国，膀胱癌发病率居所有泌尿系统恶性肿瘤之首，亦为男性患者居多，且上皮细胞源性肿瘤居多，占所有膀胱癌的95%以上，而尿路上皮癌(urothelium)占90%以上，腺癌以及鳞状细胞癌相对少见[2]。虽然膀胱癌发病率较高，但其发生发展的分子生物学机制并不完全清楚。因此，随着细胞遗传学与分子生物学的快速发展，产生了关于肿瘤免疫治疗、特异基因靶点的基因治疗以及RNAi干扰技术的产生，为更好诊治膀胱肿瘤展现了新的前景。研究发现新的膀胱癌分子标志物将为膀胱癌关于基因诊断与治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 miR-218靶基因预测及Robo1表达水平分析 采用微小RNA在线靶点预测数据库Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)在线预测miR-218潜在作用靶点，其预测机制为miR-218序列与靶基因3’-UTR区域靶向结合。分析显示，Robo1基因mRNA 3’-UTR区可与miR-218靶向结合。在TCGA数据库中分析Robo1在多种肿瘤中的表达水平，及其与膀胱癌患者的临床分期关系。

1.2 Robo1突变分析 在用TCGA在线分析工具cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)对Robo1的在膀胱癌及多种实体肿瘤中的突变情况进行分析。包括突变种类、突变频率及对应的突变位置。

1.3 Robo1相关基因蛋白网络构建及KEGG信号通路分析 在STRING数据库中，构建Robo1相关基因表达的蛋白—蛋白相互作用网络，构建条件为：相互作用来源为实验、共表达、数据库、基因融合等；最小相互作用评分为0.07，相互作用蛋白不超过20个。同时在KEGG数据库中(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)，对相互左右的蛋白网络进行信号通路富集。

1.4 Robo1表达与患者预后 根据Robo1表达水平，分为高、低表达组(高表达组：Robo1基因mRNA表达水平≥肿瘤组织中的中未表达数；低表达组：Robo1基因mRNA表达水平<肿瘤组织中的中未表达数)，比较两组患者无疾病进展生存(DFS)和总生存(OS)是否存在差异。高、低表达组生存比较采用log-rank检验。

1.5 统计学方法 数据分析采用Stata12.0软件完成，相关基因表达、预后、突变等分析采用在线数据分析工具，双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-218靶向 Robo1及Robo1表达水平分析 Targetscan微小RNA靶基因预测数据发现miR-218能与Robo1基因3’-UTR靶向结合，从而抑制Robo1基因的表达(图1a)。TCGA数据中显示Robo1在多种肿瘤中表达水平变化不显著，在膀胱癌患者癌组织和癌旁组织中Robo1基因mRAN表达水平并无显著差异(图1b)，其表达水平与患者分期也无相关性(P>0.05)，见图1c。

图1 miR-218靶向 Robo1及Robo1表达水平分析

2.2 Robo1突变水平分析 Robo1基因主要突变形式为融合突变、扩增突变、深度缺失突变，具体突变位置见图2。

图2 Robo1基因突变水平及位置分析

2.3 Robo1相关基因蛋白网络及信号通路富集 STRING数据库中构建Robo1相关基因蛋白网络，网络中共有21个相关基因，基因间的联系为75，平均节点相关度为7.14，区域聚类指数为0.77，相关蛋白网络富集明显(P<0.001)，见图3。 蛋白网络相关基因KEGG信号通路主要富集于Ras信号通路、Rap1信号通路及cGMP-PKG信号通路等，见表1。

图3 Robo1基因相互作用蛋白网络图

表1 Robo1相关基因蛋白网络KEGG信号通路富集

2.4 Robo1表达与患者预后 Robo1高低表达膀胱癌患者DFS和OS间均存在明显的差异(P<0.05)。DFS(HR=1.40,P=0.044)和OS(HR=1.40,P=0.037)在Robo1高表达组患者显著低于低表达组，提示Robo1高表达是膀胱癌预后不良的因素，见图4。

图4 Robo1表达与膀胱癌患者生存期分析

3 讨论

Roundabout蛋白，也称为Robo受体，为一种跨膜蛋白受体。有四种Robo受体在哺乳动物中被发现，分别为Robo1、Robo2、Robo3、Robo4[3-4]。成熟个体的多数组织和器官中均可表达Robo1与Robo2，但在发育中的神经系统表达明显，Robo3仅表达于发育中的中枢神经系统，而Robo4则主要表达于内皮细胞中。以往研究表明，Robo可在胰腺癌、卵巢癌及口腔癌中表达[5-6]。Robo1和Robo4可广泛表达于卵巢癌组织和细胞胞浆中，且与卵巢癌的侵袭和转移密切相关。鉴于现有的研究已经证实，Robo基因与肝癌、直肠癌等多种肿瘤的病理有关，因此，我们有理由推测Robo基因也可能与膀胱癌的病理有关。鉴于文献检索显示，尚未有Robo基因与膀胱癌病理方面的研究结果，因此，开展本研究以揭示膀胱癌发生的病理及寻找关键的分子标志物，寻找膀胱癌治疗的新方法、新靶点。

在本研究中，我们采用生物信息学分析方法，证实了Robo1基因在膀胱癌等多种肿瘤中存在突变，并在膀胱癌等的发生发展中可能发挥作用。Robo1表达水平与患者预后有关，高表达膀胱癌患者预后较差，总生存和无疾病进展生存均较低。提示其表达可作为膀胱癌患者预后的分子标志物。同时miR-218可靶向Robo1并降低其表达水平，为开发针对Robo1的靶向药物提供了新的潜在靶点。

但本研究也存在一定的局限性，虽然研究结果证实miR-218可靶向Robo1并降低其表达水平并可作为膀胱癌预后分子标志物和潜在靶向治疗药物开发新靶点，但其具体调控的分子机制并未完全阐明，下一步，应采用体内外实验分子实验，对上述结果进行证实，完善其分子调控机制。