黄国文,张卫军,邓胜国

(湖南科技学院 化学与生物工程学院,湖南 永州 425199)

油茶(Camelliaoleifera)是山茶科(Theacae)山茶属(Camellia)中重要的木本油料树种，主要分布在湖南、广西、四川、福建等18省区[1]，其种子榨取的茶油含有丰富的油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸，并含有生理活性强的甾醇、生育酚和角鲨烯，对于降低胆固醇、预防和治疗人类常见冠心病和高血压等心脑血管疾病有重要作用；此外，茶油可以深加工成高级天然护肤品，茶子饼富含茶皂苷、多酚、多糖等生物活性物质[2]，因此综合开发油茶可以提高油茶的经济价值和社会效益。叶面肥可以迅速补充植物生长发育所需要的营养成分，也可以弥充根部吸收肥料能力的不足，有利于培养出生长健壮的植株。叶面肥应用于油茶苗木施肥的技术得到了广泛的研究，如：使用尿素和磷酸二氢钾作为叶面肥来促进油茶幼苗和幼树生长[3]；以磷酸二氢钾、尿素、赤霉素、硼肥作为叶面肥来促进湘林1号油茶的6 a生嫁接植株的枝条和有效芽生长[4]；以硝酸钠、硫酸镁、硫酸锌、钼酸铵等作为叶面肥来提高4 a生和40 a生油茶的结实能力[5]；以标植营养液、植标植物营养液、果树专用植物营养液、农药、植物生长调节剂等作为配方施肥可以促进油茶苗木生长、染病植株复壮和提高座果率[6-8]等。1 a生油茶苗出圃时植株主根被短切并且须根少导致成活力不强，茎秆柔弱易倒伏，栽培时可以喷施叶面肥来促进幼苗生长。南方红壤土由于长期的经受雨水的淋溶作用和土壤酸化作用，导致土壤中的氮、磷、钾等严重不足，硼、钼和有效锌等元素严重缺乏。虽然对油茶幼苗喷施磷酸二氢钾、尿素和氯化钾的叶面肥可以促进油茶苗的生长，但是施肥以后油茶苗存在一定的落叶现象。目前认为，硼是细胞壁半纤维素的组成部分；锌是色氨酸合成酶的辅酶，参与生长素的合成，苹果(Maluspumila)缺锌得小叶病；钼是硝酸还原酶的辅酶，参与氮代谢，说明钼锌硼可能参与植株叶片的生长。因此,本文在磷酸二氢钾、尿素和氯化钾3种肥料配比优化的基础上，对硼酸、硫酸锌和钼酸钠进行三因素三水平的正交实验设计来组合叶面肥，研究这些叶面肥对栽培的1 a生油茶出圃苗生长的影响，旨在培养出生长健壮的油茶栽培植株，为其丰产栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于湖南科技学院油茶实验基地(111.84°E，26.58°N)，属于中亚热带大陆性季风湿润气候。全年四季比较分明，平均气温为17.6～18.6 ℃，无霜期286～311 d，日最低气温0 ℃以下的天数只有8～15 d。多年平均降雪日数为3～7 d，极端最低气温在-4.9～-8.4 ℃之间。年平均降水量1 200～1 900 mm。栽培土为强酸性红壤，养分含量低，适耕性差[9]。

1.2 试验材料

以1 a生湘林210号油茶苗为研究对象，在2019年3月15日从苗圃的营养钵中移栽到含有红壤土的培养盆中室外种植，待其生长30 d后进行施肥实验。硼酸(H3BO3)、硫酸锌(ZnSO4)、钼酸钠(Na2MoO4)均为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂(纯度≥99.5%)。

1.3 试验设计

以优化的0.1%氯化钾、0.2%磷酸二氢钾和0.3%尿素为母液(此研究在2018年上半年完成，资料未发表)，以硼酸、硫酸锌和钼酸钠等3种肥料进行L9(34)的正交试验设计配比叶面肥，共有9种配比方法(表1)。这3种微量元素肥料的施肥预备试验在2018年下半年进行并初步确定了3种无机盐的较优水平(资料未发表)。在2019年4月中旬—7月中旬，对9种叶面肥喷施组、水平优化组和对照组(喷施水分)进行施肥试验，每种叶面肥喷施10株，水分喷施10株，共110株，分成11组，每组每株分别挂牌编号，以防止混淆。用喷雾器将肥料喷施到每一株材料的每一个叶片背面，每隔8 d在晴天傍晚喷施1次，共喷施11次。

表1 L9(34)正交试验中3种肥料的配比方法Tab.1 The ratio method of three kinds of fertilizer arranged by L9(34)orthogonal table

1.4 验证试验

以对油茶生长影响较好的优水平硼酸(第2水平)、硫酸锌(第2水平)和钼酸钠(第1水平)以及已经优化的尿素、磷酸二氢钾和氯化钾的肥料组合成优化的叶面肥，并以水作为对照喷施油茶幼苗，研究了优化的叶面肥对油茶生长发育的影响。

1.5 试验指标

在最后一次施肥后的第3 d测定每个处理的叶片的叶绿素、可溶性总糖、可溶性蛋白和多酚的含量,在第8 d测定多酚氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活性，第15 d测定叶片的结构，并记数每个植株的叶片数和芽数目。

采用比色法测定叶片中叶绿素含量[11]。采用沸水提取和蒽酮比色法测定叶片中可溶性总糖的含量，采用0.02 mol/L磷酸缓冲液提取叶片中可溶性蛋白质并以双缩脲法测定蛋白质的含量[11]。采用60%乙醇在60 ℃水浴锅中浸提材料60 min来提取多酚，以酒石酸亚铁比色法来测定多酚含量[12]。取处理的植株叶片，用比色法测定过氧化氢酶的活性、滴定法测定过氧化物酶活性、氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶活性、多酚氧化酶活性[13]。取每个处理的植株主干上部倒数第3片叶、下部顺数第3片叶和中间部分的叶片，在离叶柄2 cm和离主叶脉左右1 cm区间做徒手横切片，在显微镜下用目镜测微尺测定叶片厚度、栅栏组织、海绵组织、上表皮和下表皮的厚度。

1.6 数据处理与分析

用Exce1软件统计各种数据并进行极差分析，用SPSS 19软件进行方差分析并用Duncan法进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 不同叶面肥对油茶幼苗叶片数和芽数的影响

叶片是植物的一种营养器官，能够利用空气中二氧化碳和水制造糖类物质，也能够吸收叶片表面的无机盐溶液来调节物质代谢，制造叶片和芽(顶芽和叶芽)生长所需要的的营养物质。植物的叶片和芽的数量能够反映出植物的代谢强度和受到无机盐的影响强度。针对9种混合肥料喷施的油茶植株统计3株的叶片数目和芽数目并进行极差分析和方差分析，计算叶片数目和芽数目的比值(表2)。结果表明，3种无机盐能够调节油茶叶片数目和芽数目的生长，影响油茶叶片数目多少和叶芽比大小的顺序都为钼酸钠、硼酸、硫酸锌，影响油茶芽数目的顺序为硼酸、硫酸锌、钼酸钠。3种无机盐溶液中钼酸钠以第1水平的作用有利于促进叶片和叶芽比的增长，硫酸锌以第2水平的作用有利于促进叶片数和芽数量的增长，硼酸以第2水平的作用有利于促进叶片数目的增加和叶芽比的提高。

表2 3种无机盐对油茶幼苗的叶片数、芽数和叶芽比值的影响Tab.2 Effects of three inorganic salts on the number of leaves and buds and the ratio of leaves to buds of C.oleifera

2.2 不同叶面肥对油茶幼苗叶片结构的影响

植物感受叶面肥作用的最敏感器官是叶片，受叶面肥影响，叶片形态结构会发生变化。9种肥料喷施的植株叶片进行显微切片观察结果表明(表3～表4 )，3种肥料对油茶幼苗的上部叶、中部叶和下部叶的叶片厚度的影响表现出一致性，其强弱顺序为硼酸、硫酸锌、钼酸钠。油茶的上部叶、中部叶和下部叶的栅栏组织和海绵组织的厚度比值也呈现出一致性变化，都是栅栏组织多于海绵组织，3种肥料的影响顺序为硫酸锌、钼酸钠、硼酸。硼酸以第1水平和第3水平的作用有利于增加叶片的厚度，以第2水平的作用有利于增加栅栏组织与海绵组织的比值；硫酸锌以第2水平的作用有利于增加叶片厚度以及栅栏组织与海绵组织的的比值；钼酸钠以第1水平和第2水平的作用有利于增加叶片的厚度，以第1水平的作用有利于增加栅栏组织与海绵组织的比值。油茶叶片的上表皮和下表皮的厚度比值(表5)，都是上表皮厚度大于下表皮的厚度，以钼酸钠的影响最大，其次是硼酸，以硫酸锌的影响最小。上表皮和下表皮的厚度比值与栅栏组织与海绵组织的厚度比值并没有表现一致的变化规律。

表3 3种无机盐对油茶幼苗叶片厚度的影响Tab.3 Effects of three inorganic salts on the leaf thickness of C.oleifera

表4 3种无机盐对油茶幼苗叶片栅栏组织厚度与海绵组织厚度比的影响Tab.4 Effects of three inorganic salts on the ratio of the thickness of palisade tissue and sponge tissue of C.oleifera leaves

表5 3种无机盐对油茶幼苗叶片上表皮厚度与下表皮厚度的比值影响Tab.5 Effects of three inorganic salts on the ratio of the thickness of upper epidermis to that of lower epidermis of C.oleifera leaves

2.3 叶面肥对油茶幼苗叶绿素、可溶性总糖、蛋白质和多酚含量的影响

叶绿素是叶片吸收太阳光能和转换成电能的基础,叶绿素含量与光合作用强度密切相关。糖类是植物光合作用的直接产物，可溶性总糖是植物生长发育中需要的碳素营养的来源之一，也是植物生长发育和基因表达的重要调节因子；葡萄糖含量的标准曲线为y=0.101 1x，R2=0.998。植物中的可溶性蛋白质是氮素代谢的重要产物之一，是植物生命活动的执行者，植物蛋白质含量可以反映植物的氮素代谢程度；蛋白质含量的标准曲线为y=0.228 2x-0.000 8，R2=0.998。多酚是植物中含有酚性羟基的化合物的总称，是植物对多糖、蛋白质、脂肪等初生代谢产物进一步代谢的次生代谢产物，多酚含量可以反映植物的次生代谢强度；茶多酚含量的标准曲线为y=0.037 3x，R2=0.997。9种叶面肥处理的油茶幼苗叶片叶绿素、可溶性糖、蛋白质和多酚的含量测定结果(表6)表明，3种无机盐影响油茶叶片的可溶性总糖含量由强到弱的顺序为硼酸、钼酸钠、硫酸锌，其中硼酸、硫酸锌和钼酸钠的第1水平作用下糖的含量较高。对叶片蛋白质含量的影响顺序是硼酸、钼酸钠、硫酸锌，其中硼酸第2水平、硫酸锌第3水平和钼酸钠第1水平影响较大。对油茶叶片的叶绿素含量影响强弱顺序虽然是硼酸、硫酸锌、钼酸钠，但是极差太小和各水平间的差异不明显，说明这3种无机盐对叶片中叶绿素含量的影响较小。对油茶叶片多酚含量的影响顺序为硼酸或钼酸钠、硫酸锌，说明这3种无机盐对多酚代谢调节的机理不同。

表6 3种无机盐对油茶叶片叶绿素、可溶性总糖、蛋白质和多酚含量影响Tab.6 Effects of three inorganic salts on the content of chlorophyll,total soluble sugar,protein,polyphenol in C.oleifera leaves

2.4 不同叶面肥对油茶叶片氧化酶活性的影响

在逆境条件下，植物体内产生大量的活性氧自由基，会破坏细胞膜系统的结构，并使核酸突变，严重破坏细胞的结构和功能。植物体内的氧化酶(PPO、POD、SOD、CAT等)活性增强，能够清除活性氧物质，以促进植物的正常生长发育。9种叶面肥喷施油茶后，叶片内的多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)等4种氧化酶活性测定结果(表7)显示，3种无机盐调节油茶叶片的PPO酶活性和CAT酶活性强弱的顺序是一致的，其顺序是硫酸锌、钼酸钠、硼酸；而调节叶片中POD酶活性和SOD酶活性不同，硫酸锌可以调节POD酶的最大活性，硼酸可以调节SOD酶的最高活性。3种无机盐对油茶叶片中4种保护酶活性有不同的调节途径，这些酶在叶片细胞内共同作用以维护油茶植株的正常生长发育。根据3种无机盐作用于这4种酶均值的大小，硼酸以第1水平和第2水平的作用时PPO、CAT和SOD活性较高，以2和3水平作用时POD活性较高；硫酸锌以1和3水平作用时PPO、POD和SOD活性较高，以2和3水平作用时CAT活性较高；钼酸钠以1和2水平作用时POD和SOD活性较高。

表7 3种无机盐对油茶幼苗叶片4种氧化酶活性的影响Tab.7 Effects of three inorganic salts on the activities of four oxidases from leaves of C.oleifera seedlings

2.5 验证试验

验证结果表明，与对照相比，优化的叶面肥能够提高油茶幼苗的叶片数目、芽数目和叶芽比值，能够提高叶片的厚度、栅栏组织和海绵组织的厚度比值以及叶片的上表皮与下表皮的厚度比值(表8)。在叶绿素、可溶性总糖、蛋白质和多酚等生理活性物质的含量以及多酚氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等氧化酶活性上，优化的叶面肥处理油茶的数据比对照的都要大(表9)。说明优化的叶面肥处理的油茶幼苗生长状态和生理活性较高，叶面肥能够促进油茶幼苗的生长发育过程。

表8 优化的叶面肥对油茶幼苗叶芽比和叶片结构的影响Tab.8 Effects of the optimized foliar fertilizer on leaf /bud ratio and leaf structure of C.oleifera seedlings

表9 优化的叶面肥对油茶幼苗生理物质含量和氧化酶活性的影响Tab.9 Effects of the optimized foliar fertilizer on the physiological substance contents and oxidase enzyme activities of C.oleifera seedlings

3 讨论与结论

叶面肥是基于植物能够利用角质层的渗透性及其间隙、气孔和皮孔来吸收养料的能力而配置成的一种水溶性肥料，主要喷施在叶片、树干和枝条上，具有用量省、肥效高和针对性强的特点，可以快速补充植物发芽抽枝和开花结果所需要的营养，可以用于根系不发达的幼苗培育及植物的缺素症的针对性施肥，也可用于微量元素施肥[14-15]，是一种能够保障植物正常的生长发育所需养料的速效肥。左继林等[16]研究认为，1.5%尿素能显著促进油茶幼苗高的生长，0.1%硼肥+0.2%磷酸二氢钾显著促进其地径的生长，0.15%硼能显著提高油茶叶片的叶绿素含量。叶面肥为3 g/L的尿素和1 g/L的磷酸二氢钾混合肥对窄叶西南红山茶(Camelliapitardiivar.yunnanica)苗木树高、地径和冠幅的促进作用有显著影响[17]。油茶苗期对养分需求由多至少的规律为N、K、P，油茶苗期叶面肥N肥总量是关键因素，并且适当N、P、K配比能够促进油茶幼苗吸收微量元素[16]。植物氧化酶类(过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等)的协同作用，有利于维持活性氧的代谢平衡，保护细胞内的膜结构[19]，有利于植物的生长发育。

由于可溶性总糖是植物生长发育所需的能源物质来源和结构成分之一，并对植物的生长发育和基因表达起调节作用[20]；可溶性蛋白大多数是参与植物体内各种代谢的酶类，是调控植物总代谢能力一个重要指标；叶绿素是植物吸收太阳光能的物质，是植物进行光合作用的前提和基础；植物氧化酶类是保护细胞结构免受活性氧和过氧化物破坏的蛋白质。植物体内这些活性物质的含量多少和保护酶活性的大小表现出植株生长发育的强弱。矿质元素是植物生命活动过程中不可缺少的无机营养成分。氮是植物体内蛋白质、核酸、磷脂、叶绿素、激素和维生素等的组成元素；磷是核酸、磷脂、核苷酸衍生物(如ATP、FMN、FAD、NAD、COA等)等的组成元素，参与糖类、蛋白质和核酸的代谢活动，也参与细胞分裂和增长；钾主要以离子形式存在于生命活动旺盛的部位，起酶促作用，也参与糖类的合成和运输。研究表明适当比例的氮磷钾肥能够促进油茶幼苗的生长发育。本文在氮磷钾肥的基础上利用正交试验设计配比硼酸、硫酸锌、钼酸钠等3种无机盐混合溶液作为叶面肥，研究这些叶面肥对油茶幼苗生长和生理生化特征的影响。结果表明，钼酸钠以第1水平的作用，有利于提高油茶叶片数目、芽数目和叶芽比值，提高上部叶和中部叶的栅栏组织和海绵组织的比值，提高POD和SOD酶活性，提高可溶性总糖和蛋白质的含量，表明钼作为硝酸还原酶的成分，不仅参与氮代谢，也与细胞的分裂和分化密切相关，提高叶片的生长数量。硫酸锌以第2水平的作用，有利于提高油茶的叶片数和芽数，提高叶片厚度和中部叶的栅栏组织和海绵组织的比例，4种酶的活性较低和叶绿素含量较多，说明锌作为色氨酸合成酶的辅酶，参与生长素和叶绿素的合成，参与细胞的分裂、生长和分化。硼酸以第2水平的作用，有利地影响油茶芽数和叶芽比，提高叶片栅栏组织与海绵组织的比值，提高蛋白质和多酚的含量，表明硼作为细胞壁半纤维素的组成部分，参与细胞的分裂、生长和分化，与维持叶片和芽的健康生长相关。用优化的叶面肥喷施油茶幼苗的验证试验的结果表明，优化水平处理组的各项指标比对照组的都要高，表明优化的叶面肥能够促进油茶幼苗的生长发育。因此，喷施以N、P、K肥为基础的钼酸钠第1水平(0.01%)、硫酸锌第2水平(0.05%)和硼酸第2水平(0.2%)的混合叶面肥培养出来的油茶其叶片厚实，叶绿素、可溶性多糖和蛋白质含量丰富，叶芽比例适当，PPO、CAT、POD和SOD等氧化酶活性强，使用该叶面肥能够培养出生长健壮的油茶苗木。本研究结果将为使用叶面肥来培养生长健壮的油茶实生苗和嫁接幼苗提供参考。