伍晴，罗银河*，王孟清，马晓萌

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9）是一种由RNA 指导Cas 核酸酶对靶向基因进行特定DNA 修饰的技术［1］。CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。人工改造后的gRNA 与Cas9结合后，通过PAM 序列指导Cas9剪切DNA双链，造成DNA双链断裂。

CRISPR/Cas9 只需合成一个gRNA 就能实现对基因的特异性修饰，Cas 蛋白不具特异性。编码gRNA 的序列不超过100 bp，因此比构建TALENs 更简单方便。每一对TALENs 都需要重新合成，而用于CRISPR 的gRNA 只需要替换20 个核苷酸就行。较短的gRNA 序列也避免了超长、高度重复的TALENs 编码载体带来的并发症，且廉价，可操作性强［2］。

支气管哮喘的病理机制复杂，与气道上皮细胞损伤、T 细胞亚群的改变、气道炎症、气道高反应性、气道重塑、神经生长因子等因素密切相关，近年来，神经-内分泌-免疫（Neuroendocrine-immune，NEI）网络假说在哮喘发病机制研究中也逐渐得到重视。有研究发现，神经免疫信号蛋白4D（Sema4D）在神经和免疫系统中表达且作用。在免疫系统中，Sema4D 在T 细胞表面被发现，并调节T 细胞启动。Sema4D 作为免疫性脑信号蛋白，参与多种免疫，在细胞间通讯、细胞迁移、免疫调节中起关键作用，对气道重塑也有一定的促进作用［3-4］。此外，它还对巨噬细胞、DC 细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞有刺激作用，并被定义为Th2 驱动的肺病理和生理学的重要调节因子，导致气道炎症的产生［5］。由此可见，Sema4D 与哮喘病理密切相关，但具体机制尚不明确。

本研究拟利用CRISPR/Cas9 技术对小鼠Sema4D基因进行靶向敲除，并从基因组对小鼠进行鉴定和验证，以期构建Sema4D 基因敲除小鼠哮喘模型，为进一步研究Sema4D 在病毒诱发哮喘NEI 网络紊乱中的作用提供基础。……