惠宁军,闫红霞,叶义平,马家富,周祥兴

(梧州市中医医院，广西 梧州 543000)

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是临床常见的创伤性疾病，常导致损伤节段以下发生截瘫，同时带来诸如肺炎、尿路感染、慢性肾炎和肾功能衰竭等严重并发症，对患者身心造成巨大伤害[1-3]。据美国国家SCI统计中心统计，SCI美国发病率为53/100万，并且每年预计增加1.7万余人，不完全性截瘫患者发生率为45%，且仅有0.4%的患者可以恢复正常[4]。SCI发生以后许多炎症因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10、IL-6及IL-4等呈高表达的趋势，SCI发生以后损伤局部促进炎症细胞释放炎症因子产生炎症反应，促使损伤局部内环境发生紊乱[5]，在SCI的神经再生当中发生正面或者负面的影响。TNF-α通过趋化因子MIP-2的趋化作用激活中性粒细胞及单核细胞产生大量蛋白水解酶及氧自由基等破坏作用物质，加重脊髓损伤的发生，在脊髓损伤炎症的发生与表达中起重要作用[6-7]。本课题通过制作SCI大鼠模型，以PCR、WB技术检测TNF-α、MIP-2基因及蛋白的表达，总结电针刺激对SCI大鼠的生物医学作用，初步探讨电针干预对SCI神经修复的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验材料

1.1.1 实验动物 本实验经广西医科大学动物实验伦理委员会批准(伦理批准号201712001)，实验动物许可证号：SCXK桂2014-0002。实验动物大鼠由广西医科大学提供SPF级SD雌性大鼠共70只，体质量180 g左右。

1.1.2 实验材料 解剖剪-直(商品型号：S13005-14)、精细剪-尖头(商品型号：S12012-12)、止血钳-弯(商品型号：F23006-14)、不锈钢微型血管夹(商品型号：R31005-10)、血管夹夹持器-配合不锈钢微型血管夹(商品型号：R34001-14)、持针钳-直(商品型号：F31031-15)、医用缝针(商品型号：F33111-24)、缝线(商品型号：F34004-00)均选购于深圳瑞沃德生命科技有限公司；华佗牌电子针疗仪(商品编号：30440175116)、华佗牌无菌针灸针(商品编号：30440175332)均由昆明康盛医疗器械有限公司提供。Brdu(antibody公司，货号：66241-1-Ig)，注射用青霉素钠(南京诺维赞，货号：Q111-01)。

1.2 实验大鼠分组

70只大鼠中64只随机分为4组，即对照组、预标记组、损伤后标记组和足阳明胃经电针干预组(以下简称电针组)，每组16只，剩余6只作为死亡大鼠备用。因为本课题组有检测增殖细胞的必要，故需应用Brdu腹腔注射作为增殖细胞的标记。①以标记损伤前保持分化增殖的细胞为目的，予对照组及预标记在操作前给予Brdu连续10 d腹腔注射，预标记组于第11天制作脊髓损伤模型，分别于第3天、10天、17天、24天取材，对照组于第11天行胸10节段椎板切除；②标记损伤后活化增殖的细胞为目的，给予电针组、损伤后标记组在制作脊髓损伤模型后连续10 d腹腔注射Brdu，电针组予足阳明胃经足三里、伏兔穴电针干预，干预完毕后分别于损伤后3 d、10 d、17 d与24 d取材。

1.3 实验大鼠造模

充分麻醉后行俯卧位，去毛消毒备皮，平剪剪开T9～11皮肤，切开约5 cm，逐步切开皮下筋膜、竖脊肌和脊间肌以充分暴露手术节段棘突、横突、椎板和锥弓根等结构，轻度弯曲脊柱，以T9～10椎间隙为突破口小心的咬掉T10椎板，慢慢咬至锥弓根直至椎体边缘，术野中清晰的暴露硬脊膜包裹的脊髓，以微型血管夹夹闭脊髓，夹闭25 s以后松开，夹闭过程中如见大鼠尾巴左右摆动或者松开血管夹后见以肉眼可见淤血痕迹是为造模成功，具体实验步骤见图1所示。术后逐层缝合筋膜、肌肉和皮肤，为防感染术后3 d进行腹腔青霉素注射。

注：A实验大鼠及器械；B暴露脊髓组织；C微型血管夹夹闭脊髓组织；D可见夹闭后的脊髓夹痕。

1.4 造模后大鼠的电针干预

足阳明胃经电针干预组给予足三里及伏兔穴电针干预，穴位选取参考《实验针灸学》[8]，针刺深度2 mm，电针选择疏密波，刺激强度12～15 mV，留针时间30 min，每个周期连续干预5 d，周末2 d休息。对照组和预标记组、损伤后标记组不进行电针干预。

1.5 检测方法

1.5.1 BBB评分 国际公认能精准的用于损伤后下肢运动功能评价[9]。

1.5.2 实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR) 将冻存脊髓组织用液氮浸润研磨后，取100 μL样本匀浆加入1 mL TRIzol提取总RNA，对RNA浓度进行测定，电泳检测RNA纯度。根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA后分装，-20 ℃保存备用。设计大鼠内参GAPDH、TNF-α和MIP-2引物,详见表1，按试剂盒操作说明配置体系后用ABI7500荧光定量PCR仪扩增。检测结果采用2-△△Ct法进行处理，计算目的基因的相对内参的表达量。具体引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.3 Western blot(WB检测) 将脊髓标本置于液氮并研磨提取组织蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，各标本蛋白样品加上样缓冲液；制备SDS-PAGE凝胶、上样、电泳、转膜、封闭、一抗共孵育(TNFα蛋白抗体稀释比1∶400；MIP-2蛋白抗体稀释比1∶200)、洗涤、二抗共孵育、显影、凝胶成像仪成像、拍照记录和灰度分析。以β-actin作为内参计算相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组TNF-α、MIP-2基因mRNA表达量比较

TNF-α、MIP-2 mRNA在预标记组、损伤后标记组、电针组均呈现先升高后降低的趋势，不同时间点与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；第3天和第10天时，损伤后标记组mRNA表达高于预标记组，差异有统计学意义(P<0.05)；17 d和24 d时，损伤后标记组mRNA表达略低于预标记组，差异有统计学意义(P<0.05)；与预标记组和损伤后标记组比较，电针组mRNA表达明显降低，到24 d基本接近正常水平，差异有统计学意义(P<0.05)。说明在电针治疗下，随着损伤不同程度的修复，炎症因子mRNA表达水平也逐渐恢复正常。详见图2～3、表2～3。

图2 TNF-α扩增曲线图

图3 MIP-2扩增曲线图

表2 不同时间点TNF-α mRNA表达量

表3 不同时间点MIP-2 mRNA表达量

2.2 各组TNF-α、MIP-2蛋白表达量比较

与对照组相比，TNF-α、MIP-2在预标记组、损伤后标记组和电针组均有一定程度的升高，差异有统计学意义(P<0.05)；损伤后标记组与预标记组比较，3 d和10 d时略高，差异有统计学意义(P<0.05)；17 d和24 d时略低于预标记组，但是整体差异无统计学意义。与预标记组和损伤后标记组相比，电针组整体明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。到24 d基本接近正常水平。说明在电针治疗下，随着损伤不同程度的修复，炎症因子蛋白表达水平也逐渐恢复正常。详见表4～5、图4。

表4 不同时间点TNF-α蛋白表达量

表5 不同时间点MIP-2蛋白表达量

注：A为对照组；B为预标记组；C为损伤后标记组；D为电针组。

3 讨论

SCI分为原发性和继发性。原发性脊髓损伤发生后，机体随之出现包括缺血、缺氧、出血、水肿和炎症等病理变化导致内环境发生紊乱[10-12]，局部组织缺血、缺氧导致血管活性物质的释放及脊髓血液灌流的改变被视为脊髓缺血而致再灌注损伤[13]。SCI发生后炎症细胞产生的炎症因子是继发性SCI随之发生的重要原因之一[14]。MIP-2通过与其受体CCR2结合发挥生物学效应，诱导肿瘤坏死因子TNF-α刺激激活微型血管内皮细胞的粘附因子的表达，从而激活单核细胞、中性粒细胞趋化因子产生，最终导致白细胞聚集、粘附加重损伤区域炎症反应，从而激活胶质细胞，导致胶质增生和胶质瘢痕形成及继发的毒性作用，最终导致脊髓组织炎性坏死[15-17]。潘宏等[18]在研究中指出电针刺激可能是通过参与中枢神经系统的小胶质细胞和星形胶质细胞的乙酰胆碱释放的调控，激活细胞表面的a7亚单位的N型ACh受体(a7nAChR)，从而减少炎性TNF-α的释放[19]。

脊髓损伤中医古称“体惰”，属于“痿病”之范畴，《黄帝内经·素问》提出:“治痿独取阳明”，并成为后世治痿准则，《素问·痿论》解释了其机理：足阳明胃经为五脏六腑之海，脏腑充盈，气血运行通畅，则筋骨强、关节通利。所以《灵枢·根·结》有云：治疗痿病，取之阳明。“足三里”穴为足阳明胃经之合穴，是人体强壮大穴，针刺足三里可补益素体阳气，增补气血之亏损，具有调理脾胃、补益气血和舒筋通络之功，古人把“足三里”穴视为疾病治疗要穴，《千金翼方·杂法第九》有言：凡一切疾病，皆可灸足三里；“伏兔”穴位于膝上6寸大腿外侧，起于肉间，往下穿过皮肤筋膜后为股直肌，是为维持下肢功能主要肌肉，基于以上理论故针刺足阳明胃经取“足三里”“伏兔”穴。针刺治疗强调平衡气血、调和阴阳，遵循的是补虚泻实原则，故为治痿的主要方法，电针是在传统中医针刺的基础上发展起来的一种现代物理疗法，通过电流波对针刺穴位进行刺激，电刺激通过胶原纤维实现信息及能量的传输，既保留了针刺作用又通过电信号传导对患者的末梢直接发挥作用而促进神经兴奋，具有针刺刺激及电流刺激的双重作用[20-22]。本研究为验证电针刺激足阳明胃经是否能对脊髓损伤局部组织验证产生影响作用，通过采用造模稳定的钳夹法制作脊髓损伤大鼠模型并予电针干预足阳明胃经穴位“足三里”“伏兔”穴。研究结果显示实验电针组MIP-2、TNF-α基因mRNA及蛋白的表达呈先上升后下降的趋势，在第3、10、17天电针组对比未经电针干预的对照组、预标记组和损伤后标记组差异有统计学意义，在电针干预进行到第24天时损伤区域MIP-2、TNF-α基因mRNA及蛋白的表达水平趋近对照组正常水平，结果显示电针干预可以逐渐的减少MIP-2、TNF-α的表达水平，证明电针刺激可以通过减少损伤脊髓组织炎症反应，从而减少脊髓组织的坏死。

总之，本实验研究通过SCI大鼠的TNF-α、MIP-2 mRNA及蛋白的表达证明电针可通过刺激足阳明胃经之“足三里”“伏兔”穴减少TNF-α、MIP-2的释放，促进SCI大鼠神经功能恢复。