李雪，张超兰*，廖长君，周永信，黄大厅，薛天利，黎秋君

(1.广西大学 资源环境与材料学院， 广西 南宁 530004；2.广西博世科环保科技股份有限公司， 广西 南宁 530007)

0 引言

六六六(HCHs)是一种高效杀虫剂，具有高毒性、难降解性和半挥发性，且易在生物体内积累[1]。HCHs半衰期长达几十年甚至上百年，生产HCHs的农药厂停产后其原址产生、积累的污染物在短期内很难自然降解[2]。高浓度的HCHs长期存在于土壤中，不仅降低土壤的酶活性，而且会通过食物链在人体内积累从而危害健康[3]。所以，对HCHs污染场地土壤的修复具有重要的现实意义，已得到许多学者的广泛关注。

HCHs污染土壤的修复技术主要有化学氧化技术、淋洗技术、气相抽提技术、热脱附技术以及生物修复技术[4-8]，其中生物修复技术因成本低、效率高、无二次污染的优势而更具发展潜力，该技术常被用于修复有机污染土壤[9]。目前国内对于场地污染土壤的生物修复多采用异位修复，其中生物堆被认为是最易实施和处理成本最低的异位修复技术，常被用来处理工业污染土壤。姜林等[10]在北京某焦化厂现场建立了工业化规模的生物堆，可处理450 m3的污染土壤，经过8个月修复，16种多环芳烃的平均去除率达71.4%。在实际工程应用上，生物堆法常可以通过生物强化和生物刺激来提高，张强等[11]在胜利油田某油泥暂存点开展生态堆修复，并通过添加海藻酸钠包埋菌剂以及缓释肥料并辅以通风工艺及浇水设备，经过为期一年的修复，C17～C36的脂肪烃降解率为93.5%，总多环芳烃降解率达78.0%以上。

此外也有不少研究表明，接种外源微生物可以提高HCHs的降解效率。KUMAR 等[12]向HCHs污染土壤中接种铜绿假单胞菌,经过15 d的培养使HCHs 4种异构体的降解率显著提高；马爱芝等[13]通过黄瓜盆钵实验发现，在土壤中接种菌株Sphingobiumsp.BHC-A后，经过15 d的培养其对HCHs降解率达到84.3%；陈楠等[14]研究结果表明,在田间实验中施加微生物菌剂可快速降解α-HCH和γ-HCH，27 d降解率分别达39.5%和100%。但是以往的研究多是采用人工污染土壤的实验室研究或者是针对浓度较低的农田土壤，而对污染时间长，污染情况复杂且污染浓度高、土方量大的化工场地污染土壤的修复效果的研究较少，本研究通过原地异位中试实验，研究了两种不同充氧方式(强制通风和定期翻堆)下外源微生物对化工场地土壤中HCHs消解的影响，并从土壤微生物群落代谢活性、碳源利用和过氧化氢酶活性等方面探讨两充氧方式下HCHs消解的可能机理，旨在为化工污染场地土壤中高浓度HCHs的生物修复提供实践支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤采自我国南方地区某化工厂长期生产HCHs车间地下2～5 m处，供试土壤理化性质如下：pH值7.70～7.90，有机碳0.54%～0.57%，土壤为黏性红壤。所用菌剂购自日本阿特尔公司，包括生物药剂、营养盐、微量元素剂和专用补助剂。

1.2 生物堆的构建

1.2.1 强制通风处理生物堆的构建

首先将污染土壤用ALLU斗进行破碎10次以上并过3目筛，混合均匀，按土壤质量的0.1%添加微生物菌剂，将微生物菌剂∶营养盐∶专用补助剂∶微量元素=40∶40∶4∶1依次溶解于水中(按30%的含水量计算所需水量)，然后将混合液与土壤充分混合均匀。底部铺设一层防渗膜，防止污染物扩散，依次在0.2、0.5、0.8 m高度处铺设一层曝气管道，每层管道由6根相接的PVC曝气管组成(布孔密度20个/m)，每根管道的水平距离为30 cm，管道一端伸出堆体连接简易测氧装置，一端连接立体泵装置进行被动曝气。为防止土壤颗粒阻塞管道孔隙，管道外侧用海绵进行包裹。堆体完成后用黑色塑料膜封盖，避免光解。每隔2 d通过喷淋补充水分，供氧每天1次，每次3 h。

1.2.2 定期翻堆处理生物堆的构建

定期翻堆处理除不铺设曝气管曝气改用ALLU斗翻堆充氧外，其余操作同上。翻堆为每周进行1次，每次翻抛1 h。

每个处理重复2次，分别于实验的第0 d、第14 d、第28 d、第49 d、第63 d取样，取样时在每个堆体按S型布设6个点位采混合样。采集的土壤混合均匀，一部分鲜样暂存于4 ℃冰箱一周内测定微生物多样性，另一部分风干用于测定六六六含量和土壤酶活性等。

1.3 分析指标和方法

1.3.1 HCHs浓度的测定

土壤样品中HCHs的提取参照EPA 3550的超声提取法[15]，净化方法采用柱层析法,参照(GB/T 14550—2003)[16]，HCHs 4个异构体的加标回收率分别为α：81.3%～118.4%；β：97.3%～125.0%；γ：79.7%～124.2%；δ：82.6%～125.2%。提取液中HCHs用外标法定量，分析条件为气相色谱GC7890B/ECD，色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为高纯氮气(>99.99%)，进样口温度为250 ℃，检测器温度为300 ℃。升温程序：初始温度150 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至240 ℃保持2 min，以25 ℃/min升至290 ℃保持2 min。柱流量为1.0 mL/min。进样器分流比5∶1，进样量为1 μL。

1.3.2 微生物指标的测定

取系统运行结束(63 d)的土壤用Biolog-ECO板[17]进行土壤微生物功能多样性的测定，分别取0、14、28、49、63 d的土壤用滴定法[18]测定土壤过氧化氢酶活性。

1.3.3 土样的基本性质测定

土样pH、有机碳的测定参照土壤农业化学分析方法[19]。其中pH采用电位法测定，土水比为1∶2.5，有机碳用重铬酸钾外加热法测定。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003进行数据处理，采用SPSS 20.0软件，通过单因素方差分析对Shannon、McIntosh、丰富度指数和优势度指数进行差异性分析，其计算方法参考文献[20]。微生物代谢活性用孔的平均颜色变化率(average well color development，AWCD)表示，AWCD值由字母A表示，计算公式[20]为

HCHs的消解率公式为

式中,D为HCHs的消解率；C0为HCHs的初始浓度值；Ct为运行不同时间HCHs的实测浓度值。

2 结果与讨论

2.1 HCHs的消解

2.1.1 土壤中总HCHs的消解

两处理总HCHs的消解情况如图1所示。从图1可以看出外源菌作用下两处理对总HCHs消解效果显著，其中定期翻堆处理的消解效果优于强制通风处理。前28 d总HCHs消解较快，在第28 d时，强制通风处理由114.26 mg/kg降至73.07 mg/kg，消解率达到了36%；定期翻堆处理则由123.21 mg/kg降至50.13 mg/kg，消解率达到了59%。28 d后消解速度变缓。系统经过63 d的运行，强制通风处理总HCHs含量降至59.76 mg/kg，而定期翻堆处理则降至35.18 mg/kg，消解率分别达到了48%和71%。

(a) HCHs浓度随时间的变化情况

(b) 不同时间段HCHs的降解率

2.1.2 土壤中α-HCH的消解

两处理α-HCH的消解情况如图2所示。从图2可以看出与刚建堆时相比，整个运行过程中两堆体α-HCH的含量均显著降低，其含量变化趋势与总HCHs变化趋势相一致，均在前28 d内消解较快，在28 d后消解速度减慢。在28 d时,强制通风处理α-HCH由75.30 mg/kg降至37.90 mg/kg，定期翻堆处理α-HCH则由83.96 mg/kg降至26.00 mg/kg，消解率均超过50%。在运行结束时(63 d)两处理α-HCH则分别降至34.55 mg/kg和14.36 mg/kg，消解率分别达到了61%和82%。

(a) α-HCH浓度随时间的变化情况

(b) 不同时间段α-HCH的降解率

2.1.3 土壤中β-HCH的消解

两处理β-HCH的消解情况如图3所示。从图3可以看出两处理对β-HCH均有不同程度的消解，且随着时间的延长消解率相应提高，但定期翻堆处理促进β-HCH消解的效果更显著。在28 d内,强制通风处理仅使β-HCH含量从35.06 mg/kg降至32.52 mg/kg，消解率为7%；定期翻堆处理由34.84 mg/kg降至21.24 mg/kg，消解率达39%。经过63 d的处理β-HCH含量则分别降至22.78 mg/kg和19.04 mg/kg，消解率分别上升至35%和45%。

(a) β-HCH浓度随时间的变化情况

(b) 不同时间段β-HCH的降解率

2.1.4 土壤中γ-HCH和δ-HCH的消解

两处理中γ-HCH和δ-HCH的消解情况如图4所示。对于γ-HCH，在外源微生物作用下经过63 d的消解，强制通风和定期翻堆两处理对γ-HCH的消解率分别达到45%和71%，运行结束后(63 d)定期翻堆处理的浓度低于1 mg/kg。63 d时两处理对δ-HCH的消解率分别为21%和24%，土壤中δ-HCH浓度均在1 mg/kg以下。

(a) γ-HCH浓度随时间的变化情况

(b) δ-HCH浓度随时间的变化情况

图4 两处理γ-HCH和δ-HCH的消解情况Fig.4 Dissipation of γ-HCH and δ-HCH in two treatments

2.2 两处理土壤微生物的响应

两处理土壤的代谢活性和碳源利用情况如图5所示。AWCD值可以反映土壤中微生物的代谢活性，以群落水平碳源利用类型为基础表达土壤中的微生物群落特征[21-22]。

(a) 两处理土壤AWCD随时间的变化

(b) 两处理土壤对六大类碳源的利用

(c) 强制通风处理对不同碳源的利用

(d) 定期翻堆处理对不同碳源的利用

2.2.1 两处理土壤微生物代谢活性

系统运行结束后(63 d)两处理土壤的AWCD变化曲线如图5(a)所示。从图5(a)中可以看出在培养时间24 h内，两处理的AWCD值变化不明显，培养时间超过24 h之后开始出现差异，对培养120 h后两处理的AWCD值进行方差分析，结果见表1。从表1中可以看出，在培养120 h后两处理组间的AWCD值达到显著性差异(P<0.05)。在整个培养周期内翻堆处理的AWCD值始终高于强制通风处理。说明外源微生物作用下翻堆处理较强制通风处理更能增加土壤微生物的代谢活性。

表1 两处理AWCD值的方差分析Tab. 1 ANOVA results of AWCD for two treatments

2.2.2 两处理土壤微生物对六大类碳源的利用

按化学基团的性质把ECO板上的31种碳源分成 6 类，即胺类化合物类、氨基酸类、糖类、酸类、醇类和酯类。土壤微生物对不同种类碳源的利用程度反映了微生物的代谢功能类群。根据对两处理土壤微生物代谢活性的分析，本研究选择120 h的AWCD值进行碳源利用分析[20]。从图5(b)可以看出，与强制通风处理相比，除胺类化合物外，定期翻堆处理对其他5类碳源的利用均增加。对醇类和氨基酸类的利用分别增加了0.229和0.134，对糖类的利用增加了0.134，对酯类和酸类的利用分别增加了0.103和0.075。图5(c)与图5(d)显示，强制通风处理和定期翻堆处理土壤中的微生物优势群落碳源利用类型均为酯类>氨基酸类>酸类，但定期翻堆处理较强制通风处理对糖类和酸类的利用明显增加。

2.2.3 土壤微生物功能多样性

Shannon指数主要反映土壤微生物群落对不同碳源的利用情况，McIntosh指数则是基于群落物种多维空间距离的多样性指数。两处理土壤微生物群落差异性见表2。由表2可以看出定期翻堆处理的各指数均高于强制通风处理，除均匀度未达到显著差异外，其他指数差异性显著。

表2 两处理土壤微生物群落差异性Tab. 2 Differences of soil microbial communities between the two treatments

2.2.4 两处理中过氧化氢酶活性的影响及与土壤中总HCHs的相关性

土壤过氧化氢酶能促进过氧化氢对各种化合物的氧化，其与土壤呼吸强度和微生物活动均有关，可以在一定程度上反应土壤微生物的活性(图6)。从图6(a)中可以看出，系统运行前两周土壤中的过氧化氢酶几乎没有变化，两周后过氧化氢酶活性开始增加，在49 d时达到最大值。在整个系统运行周期内，定期翻堆处理的过氧化氢酶活性始终高于强制通风处理。通过与土壤中HCHs的浓度比较，发现两处理土壤中过氧化氢酶活性与HCHs的浓度负相关，且定期翻堆处理在P<0.05水平上显著负相关，如图6(b)所示。这说明外源微生物作用下定期翻堆处理较强制通风处理更能增加HCHs污染土壤中过氧化氢酶的活性，从而促进土壤微生物对HCHs的消解。

(a) 两处理土壤中过氧化氢酶活性

(b) 过氧化氢酶活性与土壤中总HCHs的相关性

3 讨论与结论

从上述结果可以看出，外源微生物作用下两处理均可促进土壤中HCHs的消解，定期翻堆充氧较强制通风充氧促进HCHs消解作用明显。对于总HCHs而言，28 d的消解率可达59%，63 d的消解率达到了71%。从消解趋势来看，前28 d消解速度较快，后面逐渐减缓。从HCHs的两种异构体的消解来看，α-HCH较β-HCH更易消解，这与文献[23-24]的研究结果相一致。本研究中定期翻堆处理运行63 d后对α-HCH的降解率最高达到了82%，对β-HCH降解率最高可达45%，这与HCHs的结构有关。α-HCH的轴线氯原子较β-HCH的轴线氯原子多，而轴线氯原子可以为酶的降解提供有效点位[25]，所以β-HCH相比α-HCH更稳定更难降解。且α-HCH的挥发性强于β-HCH，所以在翻抛时更易挥发。从两处理微生物代谢活性、碳源利用、功能多样性角度分析，本研究中外源微生物作用下定期翻堆处理比强制通风处理的微生物代谢活性高，且对酯类、酸类、氨基酸类、醇类、糖类的利用提高。目前文献中报道降解HCHs的微生物类群主要有鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)等[26]，其中产碱杆菌能在以糖类化和物中的6-磷酸葡萄糖作为唯一碳源发酵生产聚β-羟基丁酸[27]，本研究中定期翻堆处理较强制通风处理对糖类的利用提高了79%。郑丽萍等[28]在研究中发现在有机氯农药污染土壤中土壤微生物利用羧酸和氨基酸相对较多，本研究中定期翻堆处理较强制通风处理对氨基酸类和酸类分别提高了35%和22%。Shannon指数可以反映土壤微生物的数量和均匀度，本研究中定期翻堆处理较强制通风处理Shannon多样性指数、丰富度指数、McIntosh指数和优势度均提高且达到显著性差异。可能是因为定期翻堆处理菌剂在土壤中混合的更均匀，使HCHs消解更快速，从而降低对土壤中微生物的毒性，且前期营养成分充足，使得微生物可以快速繁殖，HCHs降解菌也更易形成优势菌。马锋敏等[29]在研究施用微生物菌剂对参后地土壤微生物功能多样性的影响时也得到了相似的结论。

微生物分解或降解的原理主要是能产生1～3种酶，能与有机污染物发生氧化偶合反应。本研究中微生物产生能消解HCHs的酶，从而使微生物能够分解利用HCHs，降低其在土壤中的浓度，土壤中过氧化氢酶的增加刚好证实了这一点。定期翻堆处理过氧化氢酶活性始终高于强制通风处理，且增加速度更快，这与两处理对HCHs的消解情况相一致。逄焕成等[30]在研究中发现，在有机氯污染土壤中加入外源细菌可以增加土壤过氧化氢酶活性。刘继芳等人的研究也表明提高过氧化氢酶活性可以提高土壤中HCHs的消解速率[31]。

综合上述分析可以得出结论：外源菌作用下的定期翻堆处理可以显著降低土壤中六六六及其各个异构体的含量，提高土壤微生物的代谢活性、微生物多样性和过氧化氢酶活性，效果优于强制通风处理，外源微生物作用下定期翻堆处理可有效应用于化工污染场地六六六污染土壤的修复。