刘改霞 邱铨鹏 任博博 张浩为 刘辉 李雯 石晨 佘军军

结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率以及死亡率分别居于全球肿瘤的第3 位和第4 位，每年有近90 万人因其死亡[1]。在中国，近年来随着经济水平的发展和饮食结构的改变，结直肠癌发病率和死亡率持续增高[2]。肠道菌群紊乱在结直肠癌的发生、发展以及预后转归中起着重要作用。结直肠癌组织中富集的细菌如具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）、产肠毒素拟杆菌（Enterotoxigenic bacteroides）等可以通过直接诱导DNA 损伤，激活某些致癌信号通路等促进结直肠癌的发生[3]。而肠道中某些有益的细菌，如劳氏菌属可以产生短链脂肪酸，其具有抗炎，修复肠道上皮损伤，维持肠道稳态的功能[3]。

近年来大量研究显示，阑尾切除也会增加术后结直肠癌的发生率。Mcvay 等[4]最早通过患者死亡后尸检研究发现，因结直肠癌死亡的病例中阑尾切除率远高于因其他疾病（心血管疾病、其他恶性肿瘤等）死亡病例中的阑尾切除率，从而提出阑尾可能作为肠道抵抗恶性病变的一种重要结构与肠道恶性疾病密切相关。Lai 等[5]回顾性研究从1998年至2003年医院确诊的急性阑尾炎患者，发现40 岁以上有过阑尾炎病史的人群患结直肠癌的风险比是普通人群的38.5 倍。且有研究表明，长期随访阑尾切除后人群，其肠道菌群多样性和丰富度明显降低，粪便菌群组成发生明显改变[6]。随着对阑尾角色与功能研究的不断深入，大量阑尾与结直肠癌关系的相关研究相继被报道和开展中[7]，但是阑尾切除与其后结直肠癌预后之间的关系，目前尚未明确，其潜在机制也需要进一步探索。

本研究回顾了西安交通大学第一附属医院收治的结直肠癌患者的临床资料，旨在探究既往阑尾切除与结直肠癌预后的相关关系。进一步基于小鼠阑尾切除模型，诱导炎症相关结直肠癌，阐明小鼠粪便菌群组成变化，进行初步机制探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 回顾性收集2013年1月至2016年12月期间于西安交通大学第一附属医院就诊的1 092 例结直肠癌患者的临床以及病理资料。纳入标准：1）年龄20～80 岁；2）经病理组织学诊断为结直肠腺癌；3）未合并其他类型肿瘤；4）临床及病理资料信息完整。排除标准：1）结直肠癌诊断前既往患有其他肿瘤的患者；2）既往有炎症性肠病、家族性腺瘤性息肉病、遗传性非息肉性结直肠癌等遗传性结直肠癌的患者；3）阑尾切除后一年之内发生结直肠癌的病例；4）因阑尾肿瘤行阑尾切除术或结肠切除的病例。根据上述标准，最终纳入763 例病例。根据患者在结直肠癌诊断前是否存在阑尾切除史，将其分为阑尾切除组（89 例）和非阑尾切除组（674 例）。通过病历记录中既往阑尾切除病史及住院期间腹部CT 等影像学检查评价结直肠癌诊断前阑尾切除史。

1.1.2 动物实验材料 氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠购自美国sigma-aldrich 公司，粪便DNA 基因组提取试剂盒购自德国Qiagen 公司，qRT-PCR 引物由中国生工生物工程公司合成及测序，相关引物序列：普氏菌属：F：5'-AATAAGGACCGGCTAATTCCGT-3'，R：5'-CTACGCTCCCTTTAAACCCAAT-3'；拟杆菌属：F：5'-CGGTAATACGGAGGATCCGA-3'，R：5'-CCTACG CTCCCTTTAAACCC-3'；布氏菌属：F：5'-GACGGTA CCTGACTAAGAAGCC-3'，R：5'-TCAACAGTTTCCA ATGCAGTCC-3'；细菌通用引物：F：5'-GCAGGCCT AACACATGCAAGTC-3'，R： 5'-CTGCTGCCTCCCGT AGGAGT-3'[8]。

1.2 方法

1.2.1 临床数据分析 通过西安交通大学第一附属医院于生物样本信息资源中心收集结直肠癌患者去隐私化相关临床信息，包括：性别、年龄、诊断、既往史、吸烟饮酒史、家族史、治疗方法、术后是否放化疗、是否R0 切除；其中吸烟饮酒史进行分级，将吸烟状态分为3 个等级：不吸烟者，戒烟者，现在吸烟者；将饮酒状态分为2 个状态：不饮酒者，饮酒者（包括轻、中、重度饮酒者）[9]。肿瘤临床病理特征：病理诊断、肿瘤位置、肿瘤病理分期、肿瘤临床分期（采用第8 版国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会的TNM 分期）、肿瘤分化程度（采用世界卫生组织消化系统肿瘤分类标准）；其中肿瘤位置根据国际肿瘤学疾病分类，分为近端结肠（盲肠-结肠脾曲）、远端结肠（降结肠-乙状结肠）、直肠（直乙交界-直肠）[10]。预后信息：存活状态、是否复发、是否转移、死亡原因、死亡日期。

1.2.2 随访 随访信息采集方式包括门诊复查及电话随访。随访内容包括患者的疾病发展情况、生存状态及死亡原因等。随访终点为2020年3月1 日或患者死亡。纳入研究的763 例患者中，64 例患者因联系方式变更等原因失访，总失访率为8.39%。

1.2.3 动物实验 1）动物分组和模型建立：无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性C57BL/6 小鼠30 只，8～10 周龄，体重为20～26 g。所有小鼠均饲养于西安交通大学医学部动物实验中心SPF 级动物实验室，每笼5 只，饲养温度严格控制在（22±2）℃，光暗循环（光照12 h，黑暗12 h），小鼠均自由摄取食物和饮水。参照本课题组已发表研究制作小鼠阑尾切除模型，其中对照组进行假手术处理。手术操作后正常饲养7 天后，均进行氧化偶氮甲烷（AOM）+ 葡聚糖硫酸钠（DSS）结直肠癌诱导（图1）[11]。2）动物标本采集和处理：实验第11 周，所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，采集小鼠全段结直肠，剖开肠腔，收取所有粪便颗粒于-80℃冻存，在显微镜下进行肠黏膜大体观察，留取疑似肿瘤的部分肠段进行福尔马林固定，石蜡包埋切片后行H&E 染色，进行病理诊断。3）qPCR 粪便细菌定量：根据病理结果，随机选取阑尾切除组发生结直肠癌小鼠5 只，未发生结直肠癌小鼠5 只，对照组发生结直肠癌小鼠5 只，未发生结直肠癌小鼠5 只。采用粪便DNA 基因组提取试剂盒进行粪便DNA 提取。选择细菌属水平16 S rRNA 基因的保守区域（V3-V4 区域）进行引物设计，目标菌属的丰度用2−ΔCt（其中ΔCt=每个目标菌属的平均Ct 值-细菌总数的平均Ct 值）作进行计算。两组之间的差异比较采用t检验。

图1 小鼠阑尾切除后结直肠癌诱导模型制作流程图[11]

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行数据整理及统计学分析。正态分布的计量资料采用±s 表示，非正态分布的计量资料用中位数（范围）表示，计数资料用频数和百分比表示。总体生存率的分析采用Kaplan-Meier 法，组间生存比较采用Log-rank 检验。采用Cox 回归分析明确阑尾切除史是否为结直肠癌独立预后危险因素。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基本临床资料

阑尾切除组患者和非阑尾切除组患者临床基本特征如表1 所示，两组在年龄分布、性别组成、吸烟饮酒史、糖尿病史、肿瘤临床分期、肿瘤TNM 分期、术后放化疗、是否R0 切除方面差异无统计学意义（表1）。

表1 阑尾切除组与非阑尾切除组基本临床资料 例（%）

表1 阑尾切除组与非阑尾切除组基本临床资料 （续表1）

2.2 阑尾切除与结直肠癌预后的关系

Kaplan-Meier 生存分析显示，阑尾切除组中位生存时间为55.000（95%CI：38.654～71.346）月；阑尾切除组的1、3、5年总体生存率分别为：88.8%、61.8%、46.4%，非阑尾切除组的1、3、5年总体生存率分别为：89.5%，75.1%，69.3%，两组差异具有统计学意义（χ2=13.777，P<0.01，图2）。Cox 单因素分析显示：年龄、阑尾切除、肿瘤病理分期、肿瘤临床分期、肿瘤分化、肿瘤位置、糖尿病、R0 切除、术后放/化疗均与结直肠癌预后相关（P<0.05，表2）；将以上危险因素和性别纳入Cox 多因素分析，结果显示阑尾切除是结直肠癌预后独立危险因素[HR=1.475，95%CI：1.030～2.114；P=0.034，表2]。根据性别、年龄、肿瘤分化、肿瘤临床分期、肿瘤位置、糖尿病、R0 切除、术后放化疗进行校正，Cox 多因素回归结果显示：阑尾切除后1～3年内发生结直肠癌的患者其死亡风险是无阑尾切除史的结直肠癌患者的2.772 倍（95%CI：1.272～6.043，表3）。

表2 不同因素对于结直肠癌总生存率影响的Cox 单因素与多因素回归分析

表2 不同因素对于结直肠癌总生存率影响的Cox 单因素与多因素回归分析 （续表2）

表3 阑尾切除暴露时间与结直肠癌总生存率相关关系的Cox 单因素与多因素回归分析

图2 阑尾切除与非阑尾切除结直肠癌患者总生存率曲线

2.3 阑尾切除后结直肠癌小鼠的粪菌变化

利用qPCR 检测肠道细菌属水平变化，在发生结直肠癌的小鼠中，相比于未行阑尾切除的小鼠粪菌，阑尾切除的小鼠肠道中普氏菌属明显富集（P<0.01）。阑尾切除小鼠，经AOM+DSS 诱导发生结直肠癌其粪菌中，相比于未发生结直肠癌的小鼠，普氏菌属（图3A)、拟杆菌属（图3B）的相对丰度明显升高、布氏菌属（图3C）明显减少。而对于未行阑尾切除的小鼠，经AOM+DSS 诱导后不管是否发生结直肠癌，3 个菌属丰度差异无统计学意义。

图3 阑尾切除后结直肠癌诱导小鼠模型粪便中普氏菌属、拟杆菌属、布氏菌属相对丰度

3 讨论

近年来，随着对阑尾功能认识的不断深入，大量研究表明其在肠道免疫和维持肠道菌群的动态平衡中起重要作用[12]。阑尾作为肠道相关淋巴组织重要的一部分，对肠道疾病以及肠外疾病的发生、发展及转归具有一定的影响[13]。目前，越来越多的研究表明阑尾切除会增加术后罹患结直肠癌的风险[14]，本研究目的在于进一步探究阑尾切除与结直肠癌预后之间的关系以及可能潜在的机制。

本研究回顾性分析了763 例结直肠癌患者的（阑尾切除组89 例，非阑尾切除组674 例）预后情况，发现既往切除阑尾的结直肠癌患者较无阑尾切除史的结直肠癌患者，死亡风险比更高，同时，阑尾切除是影响结直肠癌预后的独立危险因素。本课题组通过建立小鼠阑尾切除模型，进行AOM+DSS 炎症相关结直肠癌诱导后，发现阑尾切除后发生结直肠癌的小鼠相比于阑尾未切除发生结直肠癌的小鼠，其粪便中普氏菌属丰度明显增加。多项研究表明普氏菌属与结直肠癌的发生发展相关，其在右半结肠癌中丰度明显增高，且与其不良预后相关[15]；正常人口腔中也富含普氏菌属，研究表明来源于口腔中的普氏菌属在肠道定植增加会引起肠道菌群的紊乱，招募更多的“坏细菌”富集，在肠黏膜上形成菌斑，引起肠道炎症，增加结直肠癌的发生[16]。

本研究认为阑尾-免疫-肠道细菌三者相互作用，相互影响，在结直肠癌发展、预后中起重要作用。阑尾黏膜层中富含Treg 细胞、M 细胞、T 细胞和B 细胞[12]，阑尾作用失调或者完全丧失，使肠道局部免疫监视功能减弱，以及肿瘤组织中免疫微环境改变，相比于无阑尾切除史的同年龄段结直肠癌患者，阑尾切除的结直肠癌患者其肠道局部免疫能力较为低下，造成其预后不良。肿瘤浸润淋巴细胞由不同比例T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、NK 细胞、巨噬细胞组成。大量研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞代表宿主肿瘤免疫防御机制，其在肿瘤组织中的丰度与癌症患者的生存率相关，包括结直肠癌[17]有研究指出肠道共生微生物可在肠道黏膜定植形成生物膜，其形成需要免疫系统的参与，其中IgA 对微生物在肠黏膜上的定植、调节和稳态维持起主要作用[18]；而阑尾是肠道分泌IgA 的主要器官，其功能的缺失会影响肠道黏膜生物膜的形成，进而影响肠道菌群以及肿瘤组织中菌群微环境的结构。而某些肠道细菌又可以通过调节肿瘤免疫微环境、肿瘤代谢等进一步导致肿瘤不良预后[19]。

本研究表明，阑尾切除1～3年内发生结直肠癌的患者其死亡风险比明显高于阑尾切除暴露时间>3年的结直肠癌患者；其可能与肠道相关淋巴组织代偿能力有关。Masahata 等[20]将无菌小鼠进行阑尾切除后发现其全结直肠以及粪便中的IgA 分泌细胞数量显著降低，且粪菌发生变化；将阑尾切除后小鼠常规饲养8 周后，发现其大肠孤立淋巴组织数量变多，体积变大，IgA 分泌细胞数量回升，与假手术组无显著差异。

根据初步研究结果，阑尾切除可能是结直肠癌不良预后的独立危险因素，其潜在机制可能与阑尾切除可以改变肠道细菌有关，但其具体机制仍需进一步研究。