艾加敏,余天飞,李 静,姜影影,柳晓东,邓振山

(延安大学 生命科学学院,陕西 延安 716000)

0 引 言

植物内生菌(Endophyte)是指能够生活在植物各组织和器官内，而不引起植物病变的一类微生物，可分为真菌、细菌和放线菌三大类[1]，自1993年A.Stierle等[2]人从红豆杉中分离得到一株能够产紫杉醇的Taxomycesandreanae的真菌后，为植物内生真菌生产天然活性物质提供了理论基础。植物的生长各阶段、药用成分都与内生菌尤其是内生真菌[3]相关，植物内生真菌的主要代谢产物为糖类、苯丙素类、醌类、黄酮类、萜类、甾体和生物碱等类群[4]，其中黄酮类化合物因具有抗炎、抗菌和抗病毒等作用而受到普遍关注[5-6]。马齿苋(PortulacaoleraceaL.)为常见草本植物，主要生物活性成分：黄酮类、生物碱、多糖类、儿茶酚、三萜类，具有抗菌、抗氧化作用、抗病毒等作用[7-10]，目前主要集中在对马齿苋代谢产物的研究，但对产黄酮马齿苋内生真菌代谢产物的研究仍比较少。

本研究从马齿苋中分离出内生真菌，以黄酮类化合物显色反应和紫外光谱特征对内生真菌代谢产物初步鉴定，筛选出产黄酮的内生真菌，扩增其18S rDNA序列，并结合菌落和分生孢子的形态特征，对菌株进行鉴定，并采用滤纸片法，测试其代谢产物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用，探究其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌最小抑菌浓度。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用野生马齿苋采自于陕西省延安市枣园镇(N36°37′22.11″，E109°25′44.09″)，用无菌采样袋避光运回实验室，材料需当天开展试验使用。

1.1.1 指示菌株

试验所用金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)由延安大学资源与环境微生物实验室提供。

1.1.2 主要仪器

GR110DA灭菌器(厦门致微仪器有限公司)，UV-1780紫外可见光分光光度计(日本岛津)，T960型PCR仪(力康生物科技有限公司)，RE-5298旋转蒸发仪(上海昕仪仪器仪表有限公司)。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水1 000.0 mL，pH自然，121 ℃灭菌20 min，配制固体培养基时，则需另加入15.0～20.0 g琼脂粉。

PYG培养基(peptone yeast glucose broth)：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏0.2 g，葡萄糖5.0 g，NaCl：0.5 g，MgSO4·7H2O：1.5 g，蒸馏水1 000.0 mL，pH 7.2～7.5，121 ℃灭菌20 min，配制固体培养基时，则需另加入15.0～20.0 g琼脂粉。

水琼脂培养基：琼脂粉17.0 g，蒸馏水1 000.0 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 样品的表面消毒

将采集马齿苋的根和茎用无菌水进行多次冲洗，去除表面尘土，待表面干燥，进行表面消毒处理，茎使用体积分数为75%乙醇溶液消毒40 s，然后再使用体积分数为3%次氯酸钠溶液消毒4 min，根使用体积分数为75%乙醇溶液消毒30 s、然后再使用体积分数为3%次氯酸钠溶液消毒2 min。样品表面消毒完全后，备用。

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1.2.2 内生真菌的分离、纯化

用无菌水冲洗消毒完全的茎和根3次，最后一次冲洗植物组织的无菌水用移液枪吸取30.0 μL移入PYG、PDA平板中，用涂布器涂抹均匀，以此作为对照组。将消毒完全的茎和根与灭菌石英砂一起研磨，加入10.0 mL的无菌水制成悬液，依次进行梯度稀释，稀释倍数分别为：10、102、103、104、105、106，将稀释好的悬液30.0 μL分别涂布在PDA固体培养基上，28 ℃，培养5 d，每个梯度设置3个平行对照，以气生菌丝和营养菌丝的形态、长度和颜色为分类依据，挑取菌丝，转接到新的PDA固体培养基上，进行菌种纯化，菌株编号依次为：AG-1、AG-2、AG-3、……AG-n。

1.2.3 内生菌代谢产物提取

将所分离纯化的马齿苋内生真菌接种至PDA液体培养基进行发酵，28 ℃，160 r/min，发酵7 d，发酵液体积为2.0 L，待发酵完毕，四层纱布过滤发酵液，除去菌丝，将滤液100 ℃水浴加热，浓缩至50.0 mL，浓缩液先用50.0 mL石油醚除去脂质等杂质，然后再用乙酸乙酯分3次萃取浓缩液中马齿苋内生真菌代谢产物，浓缩液与萃取剂的体积比始终保持1∶1，合并3次萃取剂，65 ℃旋转蒸发乙酸乙酯，蒸发至近干后用20.0 mL甲醇溶解固体物质，过0.45 μm有机系滤膜，挥干甲醇备用[11]。

1.2.4 产黄酮内生真菌筛选

参考《天然药物化学(第6版)》中黄酮类化合物显色反应[12]，对所提取的内生真菌代谢产物进行显色反应，所选择的黄酮类化合物显色反应为：硝酸铝-亚硝酸钠反应、盐酸锌粉反应、三氯化铁反应、氢氧化钠反应、乙酸镁反应。并对符合黄酮类化合物显色反应的菌株代谢产物进行紫外光谱扫描[13]，紫外光谱用甲醇作为参比溶液，建立基线，检测波长为200 nm～800 nm，扫描速度为高速，狭缝宽设置为2.0，获得光谱。符合黄酮类化合物显色反应和紫外光谱图特征的菌株代谢产物，可认为该菌株能够产黄酮，上述反应中以芦丁为阳性对照，以无菌水为阴性对照。

1.2.5 产黄酮内生真菌鉴定

使用ITS1、ITS4引物，扩增菌株18S rDNA序列进行分子生物学鉴定，总DNA提取使用索莱宝公司生产的真菌基因组DNA提取试剂盒(Fungi Genomic DNA Extraction Kit)，扩增18S rDNA序列所使用的引物为ITS1(5′-CTTCGTCATTAGAGAAGTAA-3′)，ITS4(5-TCCTCCGCTTAGATATGC-3)，PCR(polymerase chain reaction)反应体系和条件参照康为世纪生产2×Taq MasterMix(Dye)所提供的反应体系和条件，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s；72 ℃延伸 50 s，35个循环，72 ℃终延伸10 min，4 ℃低温保存。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶，90 V水平电泳30 min，凝胶成像系统拍照检查扩增结果。扩增产物送至上海生工进行测序，测序结果在NCBI(national center for biotechnology information)数据库进行BLAST比对，使用软件MEGA-X构建系统发育进化树，并将测序结果上传至GenBank，申请菌株序列登录号。

1.2.6 产黄酮内生真菌代谢产物抑菌活性测定

采用滤纸片法对产黄酮内生真菌代谢产物抑菌活性测试，待测内生真菌代谢产物1.0 g，溶于100.0 mL水中，此时质量浓度为10.0 mg/mL，并稀释成质量浓度为0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL的溶液备用。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌用无菌水配制成OD600=1.00的指示菌菌悬液，30 μL涂布在PYG(peptone yeast glucose broth)固体培养基上，将浸润在各个浓度代谢产物溶液中的滤纸片放在涂布过指示菌的PYG固体培养基上，28 ℃，培养4 d，测量抑菌圈直径。每组实验设置3个平行对照，以无菌水为空白对照，指示菌为金黄色葡萄球菌，为革兰氏阳性菌，故阳性药物1选用青霉素；大肠杆菌为革兰氏阴性菌，故阳性药物2选用头孢唑林钠。选用等浓度的青霉素和头孢唑林钠作为阳性对照。

2 结 果

2.1 产黄酮内生真菌筛选

2.1.1 内生菌代谢产物显色反应

使用PDA固体培养基从马齿苋根和茎中分离得到5株代谢产物与黄酮显色反应相似的菌株，如表1所示。其中菌株AG-10和AG-7硝酸铝-亚硝酸钠反应为阳性，菌株AG-10在所进行的显色试验中均呈阳性，初步鉴定菌株AG-10代谢产物为黄酮类化合物。

表1 显色反应结果Table 1 Results of color reaction

2.1.2 内生真菌代谢产物紫外光谱检测

黄酮类化合物的甲醇溶液普遍在200 nm～400 nm会出现两个峰带，即300 nm～400 nm峰带Ⅰ和220 nm～280 nm峰带Ⅱ[12]，以黄酮类代表物质芦丁紫外光谱图为对照，对菌株AG-10代谢产物进行紫外光谱分析，结果如图1所示，菌株AG-10在376.0 nm处有弱吸收峰，在269.0 nm、219.0 nm、207.0 nm处有3个明显的吸收峰，芦丁在357.6 nm、256.6 nm、206.0 nm处有3个明显吸收峰，芦丁和菌株AG-10代谢产物均在300 nm～400 nm和220 nm～280 nm出现吸收峰，这与黄酮类化合物吸收峰特征相符，结合显色试验反应结果，进一步说明菌株AG-10代谢产物中含有黄酮类物质。

图1 AG-10代谢产物紫外光谱图Fig.1 UV spectra of AG-10 metabolites

2.2 菌株鉴定

AG-10菌丝前期呈白色，后期呈浅黄色，菌丝稀疏平铺较长，菌落背面为浅黄棕色，菌落中间厚边缘略薄，分生孢子梗细长，分支，孢子镰刀形，无色；18S rDNA序列PCR扩增产物大小为550 bp，测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示AG-10与Fusariumoxysporum(JX045827) 18S rDNA序列相似性为99%，选择18S rDNA序列相似性大于99%的菌株序列，使用MEGA-X软件，采用N-j法构建系统发育进化树。结合菌株的形态特征和18S rDNA序列，初步鉴定AG-10为镰孢霉(Fusariumsp.)，测序结果上传至GenBank申请序列登录号：MK951708。

图2 菌株AG-10鉴定结果Fig.2 Identification results of AG-10 strain

2.3 内生真菌代谢产物抑菌活性测定

参考抑菌圈实验标准：抑菌圈直径>20 mm属于极敏感，15～20 mm属于高敏感，10～15 mm属于中敏感，7～9 mm属于低敏感，抑菌圈直径<7 mm属于不敏感[16]。

AG-10内生菌代谢产物抑菌活性结果如表2、表3所示，代谢产物抑菌效果随着代谢产物浓度的增加而增加。代谢产物质量浓度为1.0 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌有抑制作用，但效果不明显，对大肠杆菌无抑菌作用；代谢产物质量浓度为2.0 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，抑菌圈直径在4～6 mm范围内，属于不敏感，对大肠杆菌有抑菌作用，但效果不明显；代谢产物质量浓度为5.0 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌有明显抑菌作用，抑菌圈直径在10～13 mm范围内，属于中敏感，对大肠杆菌有抑菌作用，抑菌圈直径在7～9 mm范围内，属于低敏感；代谢产物质量浓度为10.0 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌有十分明显的抑菌作用，抑菌圈直径在17～19 mm范围内，属于高敏感，对大肠杆菌有明显的抑制作用，抑菌圈直径在12～14 mm范围内，属于中敏感。AG-10代谢产物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度为1.0 mg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为2.0 mg/mL。

表2 不同浓度AG-10代谢产物对金黄色葡萄球菌抑制效果Table 2 Inhibition effect of AG-10 metabolites with different concentrations on Staphylococcus aureus

表3 不同浓度AG-10代谢产物对大肠杆菌抑制效果Table 3 Inhibition effect of AG-10 metabolites at different concentrations on Escherichia coli

3 讨 论

据现有报道，赵庆云等[17]利用HLPC-UV技术从银杏中分离、筛选出7株产黄酮内生真菌，结合内生真菌菌丝形态和孢子特征，鉴定为匐柄霉、丛梗孢属、交链孢属、镰孢霉属、赤霉属、蜜孢霉、和暗梗单孢霉属。张海龙等[18]通过显色反应、薄层层析(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatograhy，HPLC)从银杏中分离得到两株产黄酮内生真菌，卷枝毛霉和尖镰孢霉。腾艾静等[13]对苣荬菜中黄酮类化合物的抑菌活性进行了研究，结果显示，苣荬菜中黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，最小抑菌质量浓度为0.5 mg/mL。

本研究从马齿苋根内筛选出一株产黄酮内生真菌AG-10，通过形态学特征，结合18S rDNA序列，鉴定为镰孢霉菌。AG-10代谢产物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑菌作用，最小抑菌质量浓度分别为1.0 mg/mL和2.0 mg/mL，且抑菌活性与浓度存在一定的量效关系，随浓度增加，抑菌活性也呈正比例关系逐渐增加。AG-10代谢产物的抑菌活性与等浓度的青霉素与头孢唑林钠相比效果较弱，可能是由于未对AG-10代谢产物进行纯化，代谢产物成分较为复杂。下一步可对AG-10代谢产物进行分离、纯化，以期获得高纯度的抑菌活性物质。

马齿苋中黄酮的药理学研究已逐渐成为一个研究的热点，有研究表明，马齿苋中的黄酮类化合物具有抗菌消炎、降脂等多种作用，本研究中AG-10黄酮类代谢产物与马齿苋植源型黄酮类化合物是否具有一定的内在联系，还有待研究。下一步应对AG-10菌株进行生理特性研究和菌体内黄酮代谢途径的研究。在初步分离的内生真菌中，AG-4、AG-5、AG-7和AG-9四株菌代谢产物黄酮类显色反应中有一种或几种微弱的阳性反应，有可能是发酵液中黄酮含量较低，代谢产物化学结构过于复杂，从而影响显色反应结果，因此下一步研究应采取高效液相(HPLC)、质谱(mass spectrometry，MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)等方法[19]，对代谢产物的化学结构进一步分析，将产黄酮类真菌的代谢产物一一分离，得到单体化合物。并通过发酵条件和工艺优化等方法和手段，提高代谢产物的产量，使利用微生物发酵生产黄酮类物质成为可能。

4 结 论

本研究从马齿苋中分离内生真菌，以黄酮类化合物显色反应和紫外光谱特征对内生真菌代谢产物进行初步鉴定，筛选出产黄酮内生真菌AG-10，经鉴定AG-10镰孢霉，其代谢产物可抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，最小抑菌质量浓度分别为1.0 mg/mL和2.0 mg/mL。