朱炜 陈启航 董志君 孙慧仪 孟子卓 陈曦 陶婧婷 于晓南

(北京林业大学，北京，100083)

中国是野生芍药的分布中心，共有7种2亚种，约占芍药组(Sect.Paeonia)植物的1/3[1]。近年来，我国研究者对芍药组植物的重视程度逐渐增加，但目前国内对于芍药组植物的新品种选育工作还不足，丰富的种质资源未得到充分的利用[2]。截至2020年10月，芍药属植物国际登录权威美国芍药牡丹协会共登录了芍药品种5 200多个，其中中国登录的芍药品种仅25个，说明我们国家的芍药品种的选育水平与欧美国家还存在较大的差距。

定向杂交，尤其是远缘杂交，是园林植物种质创新的重要途径[3]，亦是芍药属植物育种的最主要方式[2]。芍药组野生种存在二倍体和四倍体的倍性分化，经过杂交选育获得的芍药品种倍性丰富，存在二倍体、三倍体和四倍体[4-5]。多倍体植株通常具有茎秆粗壮、花色艳丽、花瓣增多、叶片肥厚、抗性强等特点。不同倍性植物杂交是多倍体和非整倍体种质创造的一种重要手段。然而，不同倍性植物杂交存在一定的亲和性障碍。目前，在兰花[6-7]、萱草[8-9]、紫薇[10]、石竹[11-12]、百合[13-14]等观赏植物中对不同倍性杂交亲和性及子代倍性分离已有一些研究报道。芍药属植物杂交亲和性研究主要集中在同倍性的牡丹亚组间杂交[15-16]、组间杂交[17-18]和芍药组内杂交[19-20]，对于不同倍性芍药品种的杂交亲和性及后代倍性的分离规律鲜见报道[21]。

本研究以16个芍药品种为亲本，设计不同倍性组合的杂交试验，研究不同倍性芍药品种间杂交的亲和性，并对部分子代的染色体数目进行鉴定，以期为芍药定向育种、多倍体种质创新提供理论依据。

1 材料与方法

选取16个芍药品种(表1)，统一种植在国家花卉工程技术研究中心北京市小汤山基地，常规田间管理。选择生长势基本一致、健壮、无病虫害植株作为试验材料。亲本材料的倍性信息参照前人研究结果[4，18，22-23]。

1.1 杂交试验

根据品种的生物学特性，共设计不同倍性杂交组合42组。杂交试验于2017年4月底至5月底进行，杂交授粉方法参照刘建鑫等[18]。

1.2 杂交亲和性

待芍药果荚变为蟹黄色时采收，获得种子，计算结实率。通过水选法筛选得到有胚种子，计算有胚率。对有胚种子沙藏处理，待胚根突破种皮时大田播种，翌年5月计算出苗率。最终，计算杂交组合的亲和性指数，以此作为杂交亲和性的指标。其中：结实率=(结实朵数/授粉朵数)×100%，有胚率=(有胚种子数/种子总数)×100%，出苗率=(出苗数/有胚种子数)×100%，单果种子数=种子总数/授粉朵数，亲和性指数=单果种子数×有胚率×出苗率。

1.3 杂交后代倍性鉴定

采用根尖压片法对获得的部分杂交后代进行倍性鉴定。倍性鉴定材料选取和处理参照朱炜等[23]的方法。染色体条数鉴定参照李懋学等[24]的标准。

1.4 数据处理

采用WPS Office软件对数据进行统计分析，采用Adobe Photoshop CS6对图片进行分析。

2 结果与分析

2.1 以二倍体为母本的杂交

以二倍体芍药品种为母本，共设计杂交组合15组，杂交739朵花，获得后代212株(表2)。从表2中可以看出，同一类倍性杂交组合中不同亲本组合结实率、单果种子数、有胚率及出苗率均存在较大差异。在二倍体×二倍体中，结实率和单果种子数最高的组合均为203，分别为90.00%和18.1；有胚率和出苗率最高的组合为202，分别为99.31%和38.89%。在二倍体×四倍体中，结实率和单果种子数最高的组合均为215，分别为97.50%和10.6；有胚率最高的组合为212，有胚率为29.74%；出苗率最高的组合为209，出苗率为66.67%。二倍体品种LT作为母本，与二倍体、四倍体品种杂交，结实率均最高，是较好的育种母本材料。

2.2 以三倍体为母本的杂交

以三倍体品种为母本，共设计杂交组合12组，杂交433朵花，获得后代3株(表3)。从表3可以看出，以三倍体品种为母本，结实率、单果种子数均普遍较低，即使获得种子，大部分组合的有胚率或出苗率也为0，最终仅获得3株后代。其中，三倍体×二倍体中结实率最高的组合为304，结实率20.00%，单果种子数为0.4；三倍体×四倍体中结实率最高的组合为305，结实率为38.81%，单果种子数为0.6。组合304和305的母本均为CH，说明三倍体品种CH可以作为母本获得种子并得到后代，是一个创造新种质的好材料。

表3 以三倍体芍药为母本的杂交结果

2.3 以四倍体为母本的杂交

以四倍体品种为母本，共设计杂交组合17组，获得杂交苗共173株(表4)。从表4可以看出，同一类倍性杂交组合中不同亲本组合结实率、单果种子数、有胚率和出苗率均存在较大差异。四倍体×二倍体中组合402的结实率、单果种子数、有胚率和出苗率均为最高，分别为95.00%、4.9、18.37%和5.56%；组合405和406结实率最低，均为0。四倍体×四倍体中组合410结实率和单果种子数均最高，分别为100.00%和7.3；组合413有胚率最高，为100.00%；组合407出苗率最高，为35.28%。四倍体品种SOH、GP作为母本不论与二倍体还是四倍体杂交，结实率均为0，说明在多倍体杂交育种中SOH、GP均不适宜作为母本。

表4 以四倍体芍药为母本的杂交结果

2.4 不同倍性品种杂交亲和性比较

从表5可以发现，在以二倍体为母本的组合中，二倍体×二倍体组合的平均单果种子数、平均有胚率和平均出苗率均显著高于二倍体×四倍体组合，其中平均有胚率的差异最为显著。在以三倍体为母本的组合中，三倍体×二倍体组合的平均单果种子数与三倍体×四倍体组合接近，平均有胚率显著高于后者，但前者的出苗率为零，未获得后代，说明在育种中以三倍体为母本时，应该选择四倍体作为父本。在以四倍体为母本时，四倍体×四倍体组合的平均单果种子数、平均有胚率和平均出苗率均显著高于四倍体×二倍体组合。综合3项指标，计算各类杂交组合亲和性指数，6类杂交组合的亲和性由大到小为：二倍体×二倍体、四倍体×四倍体、二倍体×四倍体、四倍体×二倍体、三倍体×四倍体、三倍体×二倍体。

表5 不同父本、母本倍性品种杂交后亲和性

2.5 杂交后代染色体倍性鉴定

通过根尖压片法鉴定获得的部分子代倍性(表6)。二倍体×二倍体的后代染色体数均为10条，为二倍体(图1a)；二倍体×四倍体的后代染色体数目表现多样，有10，15和20条3种情况，共鉴定出30株二倍体(图1b)，11株三倍体(图1cd)，3株四倍体(图1e)；三倍体×四倍体的后代均为四倍体(图1f)，未检测到非整倍体；四倍体×二倍体的唯一的1株后代鉴定为非整倍体(图1g)，染色体数目为2n=3x+1=16；四倍体×四倍体的后代均为四倍体(图1h)，未发现其他倍性结果。

表6 部分子代倍性

a.组合203子代2n=2x=10；b.组合213子代2n=2x=10；c、d.组合213子代2n=3x=15；e.组合214子代2n=4x=20；f.组合305子代2n=4x=20；g.组合402子代2n=3x+1=16；h.组合407子代2n=4x=20。

3 结论与讨论

染色体倍性对植物杂交亲和性具有直接的影响[25]。本研究中，不同倍性芍药亲和性由大到小为：二倍体×二倍体、四倍体×四倍体、二倍体×四倍体、四倍体×二倍体、三倍体×四倍体、三倍体×二倍体。相同倍性品种间杂交具有较高的亲和性，其中二倍体×二倍体的亲和性高于四倍体×四倍体，这可能是四倍体大孢子母细胞减数分裂过程中染色体更容易发生异常行为所致。二倍体×四倍体单果种子数要高于四倍体×四倍体，但是二倍体×四倍体的有胚率非常低，所以二倍体×四倍体的杂交亲和性要低于四倍体×四倍体。不同倍性杂交亲和性研究在其他物种中早有报道，但因材料的不同杂交亲和性结果也存在一些差异。本研究中二倍体×四倍体的单果种子数、有胚率和出苗率均显著高于四倍体×二倍体，说明在培育三倍体芍药时应该以二倍体做母本，这与郭印山等[26]对2n和4n葡萄杂交组合的亲和性研究的结果一致。王滑等[10]以紫薇为材料研究不同倍性杂交的亲和性，结果显示二倍体与四倍体的杂交中，四倍体作为母本的亲和性更高，与本研究结果不一致。在以三倍体为母本的杂交试验中，三倍体×四倍体亲和性高于三倍体×二倍体，与袁国良[27]以三倍体LAA百合做母本，与二倍体和四倍体亚洲百合杂交结果一致。

Johnston et al.[28]提出的胚乳平衡数(EBN)假说认为在杂交中当胚乳母本与父本基因组比率偏离2∶1时，胚乳将发育异常，导致种子败育。本研究二倍体×四倍体和四倍体×二倍体组合杂交种子中，胚乳的母本与父本基因组比值分别为1∶1和4∶1，故种子败育严重。而四倍体×二倍体亲和性要低于二倍体×四倍体，可能是由于芍药四倍体品种为异源多倍体，形成的胚珠数量有限且育性较低，最终导致二倍体×四倍体获得的种子和后代植株比四倍体×二倍体要多。

Stebbins[29]基于形态性状的比较和减数分裂的观察，认为芍药组内大多数四倍体类群可能是异源四倍体。而杂种芍药品种群中的多倍体均由两个及以上种源组成，故属于异源多倍体品种。前人研究表明，三倍体可产生可育的雌配子，作为母本与合适的父本杂交获得后代[30-31]。本研究中筛选出一个作为母本育性较好的三倍体品种‘Chalice’，其育性机理有待进一步研究。四倍体植株是获得多倍体种质的重要亲本材料。本研究发现4个四倍体品种‘Old Faithful’、‘May Lilac’、‘Cream Delight’和‘Roy Pehrson Best Yellow’不论作为父本或母本都具有较好的育性，是芍药多倍体育种的重要种质资源。研究还发现2个四倍体品种‘Garden Peace’和‘Scarlet O’Hara’仅适合作为父本，作为母本不结实，可能是无法形成正常的雌配子，其雌配子败育的原因有待进一步研究。

本研究中，相同倍性的杂交组合二倍体×二倍体和四倍体×四倍体后代染色体均保持与父母本相同的倍性，说明在芍药中染色体数目遗传相对较稳定，这与周建金等[6]对不同倍性蝴蝶兰杂交后代的染色体倍性鉴定结果不一致。本研究二倍体×四倍体组合产生了二倍体、三倍体和四倍体，与周建金等[6]研究结果一致，二倍体的产生可能是四倍体父本减数分裂异常产生了具有活力的雄配子，四倍体的形成可能是二倍体母本产生了未减数雌配子。袁国良[27]对百合三倍体×四倍体的杂交子代进行鉴定，发现均为非整倍体。而本研究中三倍体×四倍体产生的后代均为四倍体，未发现非整倍体，可能是三倍体母本产生的有活力的二倍体雌配子更容易与四倍体产生的二倍体雄配子结合。芍药属植物染色体属于大型染色体，数目较少，基数x=5，这说明其单条染色体控制着众多的遗传信息，增减一条均可能导致配子死亡，故在芍药属植物中尚未见有非整倍体的报道。但在本研究的四倍体×二倍体组合中，对仅获得的1株苗进行鉴定，结果显示为非整倍体(2n=3x+1=16)，可能是四倍体母本产生了有活力的二倍体+1雌配子。