APP下载

珠兰叶挥发油化学成分及其生物活性1)

2021-02-10陈黎黄岩萌孙梦雅赵满吴永祥万志兵苏兴赵昌恒

东北林业大学学报 2021年12期
关键词:烯类酪氨酸挥发油

陈黎 黄岩萌 孙梦雅 赵满 吴永祥 万志兵苏兴 赵昌恒

(黄山学院,黄山,245041)(黄山雾云间生态农业开发有限公司)

珠兰(Chloranthusspicatus)属金粟兰科常绿蔓性亚灌木植物。生长在我国南方大部分地区的山坡及茂密的林下,一般为人工栽培,少有野生[1]。珠兰是一种香花作物,其鲜花香气持久,与兰花相似,可鲜用或阴干备用。其容制的珠兰花茶,品质优良,清香幽雅,花香持久耐贮藏,是“中国四大著名茶花”之一[2]。珠兰在黄山歙县栽培历史悠久,也是歙县三大花茶品类之一[3]。珠兰亦可作园林观赏、药用等[1]。

目前,对于珠兰的研究主要集中在繁殖栽培[4-5]、珠兰花茶制作[6]、珠兰花成分分析[7-9]等方面,黄卫东等[7]以石油醚为溶剂提取新鲜珠兰花挥发油,鉴定出60余种组分[7];龚正礼等[8]采用SDE法萃取珠兰花茶样中的挥发性香气化合物,鉴定出57个组分;赵昌恒等[9]用不同干燥方法鉴定了珠兰花挥发油的化学成分,其挥发油对4种供试菌均有一定的抑制作用,2种干燥方法所得的挥发油均有一定的抑菌性、抗氧化能力及酪氨酸酶抑制作用。目前关于珠兰叶挥发油的组成、抗氧化、抑菌活性等研究处于空白,因此,为使珠兰资源得到充分合理利用,对珠兰叶挥发油化学组成及生物活性的研究十分必要。本研究以珠兰鲜叶为材料,利用水蒸气蒸馏法提取珠兰叶挥发油,利用GC-MS鉴定其成分,研究珠兰鲜叶挥发油对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2’,-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基的清除能力、抑菌活性及酪氨酸酶抑制作用,为科学评估珠兰叶的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

珠兰鲜叶于2020年10月采自安徽省黄山市歙县珠兰花人工栽培基地。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、变形杆菌(Proteusvulgaris)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)购于无锡赛维科技有限公司。

试验使用高压灭菌器(SQ510C型);AR124CN型电子天平;SpectraMax-190型全波长酶标仪;气相色谱-质谱联用仪(Agilent 7890A-5975C型);超净工作台(ZHJH-C2109B型);恒温培养箱(ZGP-2050)。

无水乙醚、体积分数为95%乙醇、过硫酸钾、甲醇购于国药集团化学试剂有限公司;营养琼脂购于北京奥博星生物技术有限责任公司;DPPH、ABTS、对羟基苯甲酸丙酯、槲皮素、左旋多巴、酪氨酸酶购自于美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 挥发油的提取

称取磨碎的珠兰鲜叶50 g置于1 000 mL圆底烧瓶中,加入500 mL蒸馏水,在挥发油测定器中加入一定量的乙醚,用电热套加热,保持沸腾状态6 h之后停止加热,将下层的水放出,收集乙醚层。在常温下挥发乙醚溶剂,加入无水硫酸钠干燥,得到淡黄色透明的芳香油。取适量挥发油用无水乙醚稀释后进行GC-MS分析,其余的挥发油密封后于4 ℃保存,用于抗氧化、酪氨酸酶抑制作用、抑菌活性测试。

1.2.2 挥发油化学成分的GC-MS分析

色谱条件:选用HP-5 MS弹性石英毛细光柱(0.25 μm,30 m×0.25 mm);载气为高纯氦气,载气流速为1.0 mL·min-1;进样量为1.0 μL;进样口温度为280 ℃,色谱柱初始温度为60 ℃,保持3 min,以5 ℃·min-1升至280 ℃,保持10 min,运行时间为57 min。

质谱条件:离子源温度230 ℃,电离方式为EI,电子能量为70 eV,四级杆温度为150 ℃;质量扫描范围质荷比(m/z)为20~400 u;溶剂延迟时间3 min;通过GC-MS分析得到总离子流色谱图,对匹配度大于80%的组分,选择NIST08为质谱数据库查找核对,并查阅文献对挥发油成分进行鉴定,采用面积归一化法计算各组分的相对百分比。

1.2.3 挥发油对DPPH自由基清除能力的测定

参照吴永祥等[10]、Cherrat et al.[11]的方法并做适当修改,取100 μL质量浓度分别为0、3.2、6.4、12.8、25.6 g·L-1的珠兰叶挥发油,分别加入50 μL 0.2 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液,充分混合,避光反应10 min,于517 nm波长下测定样品组吸光值(AS1)。样品对照组为挥发油与99.9%乙醇混合测定的吸光值(AS1B1),空白组为甲醇与DPPH溶液混合测定的吸光值(AC1),空白对照组为甲醇与99.9%乙醇混合测定的吸光值(AC1B1)。以槲皮素为阳性对照,3次重复,取平均值,并按下列公式计算DPPH自由基清除率:

I=[1-(AS1-AB1/AC1-AC1B1)]×100%。

式中:I为DPPH自由基清除率;AS1为样品组吸光值;AS1B1为样品对照组吸光值;AC1为空白组吸光值;AC1B1为空白对照组吸光值。

1.2.4 清除ABTS自由基能力的测定

参照吴永祥等[10]的方法并做适当修改,取50 μL质量浓度分别为0、3.2、6.4、12.8、25.6 g·L-1的珠兰叶挥发油,分别加入100 μL ABTS溶液,充分混合,避光反应5 min,于734 nm处测定样品组吸光值(AS2)。样品对照组为挥发油与99.9%乙醇混合测定的吸光值(AS2B2),空白组为甲醇与ABTS溶液混合测定的吸光值(AC2),空白对照组为甲醇与99.9%的乙醇混合测定的吸光值(AC2B2),以槲皮素为阳性对照,3次重复,取平均值,并按下列公式计算ABTS自由基清除率:

I=[1-(AS2-AS2B2/AC2-AC2B2)]×100%。

式中:I为ABTS自由基清除率;AS2为样品组吸光值;AS2B2为样品对照组吸光值;AC2为空白组吸光值;AC2B2为空白对照组吸光值。

1.2.5 挥发油抑菌活性的测定

参照翟大才等[12]、王小云等[13]的方法并进行适当修改,用接种针将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌接种到营养琼脂培养基,在恒温培养箱37 ℃培养24 h,待菌种活化成功后,用质量分数为0.9%的无菌氯化钠溶液冲洗长出的菌落,制备在600 nm处吸光值(OD600)为0.1的菌悬液。吸取100 μL菌悬液滴入无菌培养基,涂布均匀。分别移取10 μL(质量浓度分别为2.57、5.14、7.71 g·L-1)挥发油滴入直径为6 mm的无菌滤纸片中央,以无菌水为空白对照(CK),以对羟基苯甲酸丙酯为阳性对照,于37 ℃倒置培养24 h,测量抑菌圈直径的大小,3次重复,取平均值。

1.2.6 挥发油酪氨酸酶抑制作用的测定

向96孔板中依次加入50 μL缓冲液(pH=6.8)、80 μL 10 mmol·L-1的左旋多巴与50 μL不同质量浓度(6.4、12.8、25.6、51.2 g·L-1)的珠兰叶挥发油,震荡后加入20 μL 125菌落·mL-1的酪氨酸酶溶液,混合均匀后在37 ℃恒温下反应15 min,于475 nm波长处测定吸光值。以抗坏血酸为阳性对照,并按照下列公式计算酪氨酸酶抑制率:

I=[1-(AS3-AS3B3/AC3-AC3B3)]×100%。

式中:I为酪氨酸酶抑制率;AS3为样品组吸光值;AS3B3为样品对照组吸光值;AC3为空白组吸光值;AC3B3为空白对照组吸光值。

1.3 数据处理

利用Excel和SPSS21.0软件进行数据处理分析,采用单因素方差分析和LSD检验显著差异性。

2 结果与分析

2.1 珠兰叶挥发油的化学成分分析

珠兰叶挥发油化学成分GC-MS分析的总离子流图见图1。通过对谱库NIST08检索、质谱分析确定挥发油的化学成分,采用GC峰面积归一化法进行定量分析。从珠兰叶挥发油中共分离出92个色谱峰,鉴定有55个化合物匹配度高于80%,占挥发油总量的82.60%。由表1可以看出,珠兰叶挥发油主要成分有烯、醇、酸、烷、酯等,其中烯类化合物相对百分比最多,共有32种,占挥发油总成分的60.46%;其次是醇类化合物,共有10种,占挥发油总成分的14.52%。相对百分比大于1.00%的化合物共有20种,主要为烯类物质、醇类物质。

图中色谱峰上数字与表1化合物序号相对应

表1 珠兰叶挥发油的化学成分及相对含量

续(表1)

2.2 珠兰叶挥发油的抗氧化作用

2.2.1 珠兰叶挥发油对DPPH自由基的清除能力

由表2可知,在各质量浓度梯度中,珠兰叶挥发油呈现一定的剂量效应关系,对DPPH自由基的清除率随珠兰叶挥发油质量浓度的升高而增大,当质量浓度达到25.6 g·L-1时,清除率达到80.51%。珠兰叶挥发油、槲皮素对DPPH自由基的清除作用的IC50(清除率为50%时,挥发油及槲皮素的质量浓度)值分别为14.112、0.011 g·L-1,表明珠兰叶挥发油的DPPH自由基清除能力弱于槲皮素。

表2 珠兰叶挥发油对DPPH自由基的清除作用

2.2.2 珠兰叶挥发油对ABTS自由基的清除能力

由表3可知,珠兰叶挥发油具有显著的ABTS自由基清除作用,且呈现出剂量效应关系。其对ABTS自由基的清除率随珠兰叶挥发油质量浓度的升高而增大,珠兰挥发油质量浓度越大,清除作用越强,差异达显著水平(P<0.05),当珠兰叶挥发油质量浓度为25.6 g·L-1时,清除率达到90.17%。珠兰叶挥发油、槲皮素对ABTS自由基的清除作用的IC50值分别为3.780、0.009 g·L-1。以上结果显示,珠兰叶挥发油对DPPH、ABTS自由基清除作用的变化规律具有较好的一致性,进一步表明了珠兰叶挥发油具有一定的抗氧化作用。

表3 珠兰叶挥发油对ABTS自由基的清除作用

2.3 珠兰叶挥发油抑制酪氨酸酶的作用

不同质量浓度的珠兰叶挥发油对酪氨酸酶抑制作用见表4。随着珠兰叶挥发油质量浓度的增加,抑制酪氨酸酶的活性作用逐渐增强。当挥发油质量浓度达到25.6 g·L-1时,对酪氨酸酶抑制作用达到53.72%。珠兰叶挥发油、抗坏血酸对酪氨酸酶的抑制作用的IC50值分别为22.900、0.044 g·L-1。表明珠兰叶挥发油的酪氨酸酶抑制作用弱于阳性对照抗坏血酸,这与珠兰叶挥发油中的化学成分种类繁多有关。

表4 珠兰叶挥发油对酪氨酸酶的抑制作用

2.4 珠兰叶挥发油的抑菌作用

从表5可以看出,珠兰叶挥发油对、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有显著的抑菌效果。当挥发油质量浓度为7.71 g·L-1时,对绿脓杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的最大抑菌圈直径分别为(16.57±0.50)、(12.60±0.26)、(14.40±0.61)、(12.93±1.40)、(15.63±0.32)mm;阳性对照对羟基苯甲酸丙酯(质量浓度为1.00 g·L-1)的最大抑菌圈直径分别为(18.60±0.72)、(17.63±0.59)、(14.93±0.67)、(17.50±0.98)、(17.10±0.10)mm。表明珠兰叶挥发油、对羟基苯甲酸丙酯对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌均具有一定的抑制作用。当挥发油质量浓度为2.57 g·L-1时,对5种菌的抑制效果无差异,随着质量浓度的增大,其对绿脓杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑制效果增强,差异达显著水平(P<0.05),且在一定质量浓度范围内,挥发油对这3种菌的抑制效果呈随质量浓度增加而增大,说明其对质量浓度效应敏感度高。而变形杆菌金、黄色葡萄球菌随着挥发油质量浓度的增加,抑制效果差异未达到显著水平(P<0.05),说明挥发油对这2种菌抑制作用存在质量浓度饱和效应。总体来说,当挥发油质量浓度较大时(7.71 g·L-1),对5种菌的抑制强弱由大到小依次为绿脓杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌。

表5 珠兰叶挥发油对5种菌的抑菌圈直径

3 结论与讨论

本研究采用水蒸气蒸馏法提取珠兰叶的挥发油,通过气相色谱-质谱联用技术初步鉴定出55种化学成分,占挥发油总量的82.60%。珠兰叶挥发油化学成分以烯类(60.46%)、醇类(14.52%)化合物为主,酯、酸、烷类化合物相对较少。赵昌恒等[9]分析了2种干燥处理后珠兰花的挥发油分别为58、56种化合物,其中与珠兰叶挥发油中相同化合物有11种,两者百分比最高的均为烯类,分别占47.95%、38.84%。珠兰叶中烯类物质占60.46%,但珠兰花与叶挥发油化合物种类及百分比差异较大,珠兰花挥发油以烯、酮、醇这3类化合物为主,其中百分比较高的成分有1-(1,4-二甲基-3-环己烯-1-基)乙酮(11.33%~15.55%),别香橙烯(6.12%~11.25%),匙桉醇(5.75%~5.94%),3-甲氧基苯甲醇(5.08%~11.04%)。研究者在分析其他植物叶片挥发油的化学成分中,同样也发现烯类化合物百分比较高,如枫香叶[14]、海南白沙产裸花紫珠叶[15]、野生天竺桂叶[16]、香青叶[17]、鱼腥草叶[18]的挥发油中烯类化合物百分比分别为90.93%、46.43%、48.75%、71.32%、99.92%,本研究结果与其研究基本一致,说明多数植物叶挥油成分以烯类化合物为主。

珠兰叶挥发油含有多种应用价值且百分比较高(>1%)的化学成分,如桉油烯醇则具有抗炎的作用[19];d-杜松烯可用作香料[20];β-桉叶醇具有使体内抗自由基氧化能力提升的作用,能够减缓衰老,同时也是苍术的活性成分之一,还具有镇静、镇痛、抗抑郁等中枢神经药理作用[20-22];α-法尼烯与虎皮病诱导和昆虫诱导有关[23-24];α-古芸烯是黄花败酱挥发油的主要成分[25];α-毕橙茄醇是高效的杀白蚁化合物[26];α-蒎烯具有镇咳、祛痛、祛痰和抗真菌作用[27];(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯是泡仔姜的最重要的风味成分之一[28],也是白水栀鲜花的香气主要成分[29]。珠兰叶挥发油中百分比较高的二环大根香叶烯(15.48%),同样是楝树叶挥发油主要成分之一(15.43%)[30],二环大根香叶烯的功能目前并不明确,但楝树叶在药用、杀虫等方面具有独特的效果[30-31]。以上结果为珠兰叶的开发利用提供了参考。

珠兰叶挥发油对DPPH、ABTS自由基具有显著清除能力,对酪氨酸酶具有一定的抑制作用。抗氧化能力、酪氨酸酶抑制作用与挥发油质量浓度呈正相关关系。DPPH、ABTS自由基清除作用的抑制质量浓度分别为14.112、3.780 g·L-1。酪氨酸酶抑制作用的抑制质量浓度为22.900 g·L-1。本研究表明,在相同质量浓度下,珠兰叶挥发油对DPPH和ABTS自由基的清除能力及对酪氨酸酶抑制作用弱于槲皮素、抗生素阳性对照,因为珠兰叶挥发油是混合物,其中所含的化学成分种类繁多(92种),而阳性对照则为分析纯,如果进一步分离纯化珠兰叶挥发油中抗氧化活性物质,将会大幅提高其抗氧化和美白效果。

抑菌试验结果显示,珠兰叶挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌均具有显著的抑菌效果,其中在一定范围内珠兰叶挥发油对绿脓杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑制效果随质量浓度增高而增强,而对变形杆菌金、黄色葡萄球菌抑制作用存在浓度饱和效应。珠兰叶挥发油具有较好的抗氧化作用、酪氨酸酶抑制作用,这与抑菌活性与烯类、醇类化合物及成分间的相互作用有关,但具体是哪种或哪些化合物所起的作用尚未可知,需要进一步的研究,以筛选出更有效的活性成分。

综上所述,珠兰叶挥发油具有良好的抗氧化作用、酪氨酸酶抑制作用、抑菌活性,高百分比的烯类、醇类等活性物质是其作用的内因。本研究结果表明,珠兰叶挥发油具有一定的药用价值及作为杀虫剂、香料、美白的潜能。

猜你喜欢

烯类酪氨酸挥发油
四种百合花挥发油的GC-MS分析及评价
1起ICU耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染暴发的流行病学调查
碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌肺炎抗感染治疗的病例分析
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因组分型及耐药性评估
升血小板胶囊中连翘挥发油包合工艺研究
虾头变黑跟重金属无关
GDM孕妇网膜脂肪组织中Chemerin的表达与IRS-1及其酪氨酸磷酸化分析
祛白胶囊联合脾氨肽治疗对白癜风患者IL-10、IL-17、酪氨酸酶IgG的影响
响应面法优化水蒸气蒸馏提取牡丹根皮挥发油工艺*
2014~2018年我院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分布特点及感染患者的临床特点