韩依辛，田 雅，马广宇，丁 立，邓森荣，魏琦麟，徐志宏，2，向 蓉，2*

(1.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站， 广东广州 510640;2.岭南现代农业科学与技术广东实验室肇庆分中心，广东肇庆 526238)

随着对肉、蛋、奶等动物性食品需求的不断增加，食品安全问题也成为了一大热点问题。食品安全一直是我国重大的公共卫生问题，食源性致病菌污染是影响食品安全的重要因素，其在食品生产、加工、储存和运输等环节中均有存在的可能。消费者一旦误食被食源性致病菌污染的食品，极易引起食物中毒，还易导致各类食源性疾病的发生，严重时甚至危及生命[1]。

肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7是一种全球性食源性致病菌，人感染后会引起腹泻、出血性肠炎等，更严重的是通过产生的类志贺菌毒素作用在肾脏、肠道，引起严重的溶血尿毒症综合征[2-3]。沙门氏菌在全球细菌性食物中毒中的分离率最高，在我国也有同样的规律，摄入沙门氏菌后引起肠胃炎，典型症状包括包括发热、呕吐、严重的腹泻，极端情况下可以发展为系统性感染[4-5]。空肠弯曲菌的内毒素能侵袭小肠和大肠黏膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒[6-7]。肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和空肠弯曲菌都是重要的人畜共患病致病菌和食源性病原菌。畜禽如果感染这3种细菌，可进入到肉品中，再通过食物链传递到人。屠宰作为生猪生产和猪肉流通的“连接链”，只有做好每个环节的监测，才能真正起到保障食品安全的作用。为了解广东惠州和清远地区生猪屠宰场猪肉产品食源性致病菌的污染情况，在两地各选5家生猪屠宰场，采集498头猪肉样品进行检测，以期对当地屠宰环节的猪肉及肉制品质量安全监测提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大肠埃希氏菌O157:H7标准菌ATCC35150，肠炎沙门氏菌标准菌ATCC14028和空肠弯曲菌标准菌ATCC33291，均购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试剂 EC新生霉素增菌肉汤、SC(亚硒酸盐胱氨酸增菌液)、Bolton肉汤基础，山梨醇麦康凯琼脂平板、DHL(胆硫乳琼脂)和Skirrow血琼脂，均购自广东环凯微生物科技有限公司；用于配制Bolton肉汤的头孢哌酮、万古霉素、三甲氧苄胺嘧啶乳酸盐、两性霉素B、多黏菌素B、无菌脱纤维绵羊血，2×TaqPCR Master Mix、DNA标准DL 2 000、GeneRed核酸染料、琼脂糖、甘油、Tris碱、冰乙酸，均购自广州顺锋生物科技有限公司。

1.1.3 仪器 超净工作台(SW-CJ-1F)，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS)，上海申安医疗器械厂产品；生化培养箱(LRH)：上海一恒科学仪器有限公司产品；Eppendorf PCR扩增仪(Mastercycler X50S)，德国艾本德股份公司(Eppendorf AG)产品；核酸电泳仪(PowerPacTM Basic)，美国Bio-Rad公司产品；凝胶成像分析系统(ZF-258)，上海嘉鹏科技有限公司产品；多功能微生物培养系统(MPI)，广州市尤德生物科技有限公司产品。

1.1.4 样本 2019年，在广东惠州和清远两地各选5家生猪定点屠宰场，于凌晨屠宰过程中同步采集猪前排肉，每头猪采集猪肉50 g，每个屠宰场约50份猪肉样本，共采集生猪样本498份。

1.2 方法

1.2.1 样本的处理 屠宰场采集的猪前排肉无菌薄膜包装后0 ℃～4 ℃条件下运回实验室，无菌剪取深层的肉样10 g/份，共3份，剪碎。1份加入90 mL EC新生霉素增菌肉汤，37 ℃培养18 h～24 h，用于大肠埃希氏菌O157:H7的增菌培养；1份加入90 mL SC肉汤，37 ℃培养18 h～24 h，用于沙门氏菌的增菌培养；另1份加入90 mL Bolton肉汤(Bolton肉汤的配制参考GB4789.9-2014)，37 ℃预增菌4 h后转入42 ℃微需氧培养48 h，用于空肠弯曲菌的增菌培养。

移取2 mL 增菌液至灭菌EP 管中，10 000 r/min离心5 min，弃上清，然后加入100 μL灭菌去离子水重悬沉淀，于沸水中加热10 min～15 min，迅速转冰浴5 min，再次10 000 r/min离心5 min，收集上清液，作为下一步PCR反应模板。

1.2.2 引物设计及合成 参考文献报道[8-10]，针对大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE和fliC基因、沙门氏菌的invA基因和空肠弯曲菌的VS基因设计特异性引物，引物序列见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR检测 参考文献[8]，大肠埃希氏菌O157:H7的2个待检基因采用多重PCR，其余2种细菌普通PCR检测。PCR反应体系：粗提DNA模板4 μL，上、下游引物各2 μL(多重PCR中rfbE和fliC基因上、下游引物各1 μL)，2×TaqPCR Ma-ster Mix 25 μL，无菌去离子水补足至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 30 s，各自退火温度下40 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72℃ 10 min。取5 μL PCR产物，用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。扩增出目的条带的切胶回收目的条带后与pMD18-T载体连接，转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选出疑似阳性菌落提取质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。

表1 3种细菌的检测基因引物序列

1.2.4 分离纯化 PCR检测阳性的样本增菌液，大肠埃希氏菌O157:H7增菌液划线于山梨醇麦康凯琼脂平板，37 ℃培养24 h，沙门氏菌增菌液划线于DHL平板，37 ℃培养24 h，空肠弯曲菌增菌液划线于Skirrow血琼脂平板，42 ℃微需氧培养48 h。

挑取疑似菌落继续利用特异性引物进行PCR验证，确定阳性的菌落再次划线纯化，挑单菌落加灭菌甘油-80℃冻存。

2 结果

2.1 PCR检测结果

大肠埃希氏菌O157:H7 rfbE和fliC基因多重PCR结果见图1，疑似阳性样本在2个目的条带处均扩增出与预期大小一致的条带。 沙门氏菌invA基因的扩增结果见图2，疑似阳性样本扩增出与预期大小一致的条带。空肠弯曲菌VS基因的扩增结果见图3，除标准株阳性对照之外，无样本扩出目的条带。

1.阳性对照；2.阴性对照；3.阳性样品；4～8.阴性样品；M.DNA标准DL 2 000

以上阳性PCR产物测序序列在GenBank里经Blast比对，均确定为目的基因。

1.阳性对照；2.阴性对照；3.阳性样品；4～8.阴性样品；M.DNA标准DL 2 000

1.阴性对照；2～8.临床样本；9.阳性对照；M.DNA标准DL 2 000

2.2 细菌培养结果

大肠埃希氏菌O157:H7增菌液划线于山梨醇麦康凯琼脂平板后，长出呈淡褐色中心菌落，扁平透明，边缘光滑，直径约2 mm(图4a)。

沙门氏菌增菌液划线于DHL平板后，长出无色半透明或粉红色菌落，产硫化氢(H2S)，菌落中心黑色或几乎全黑色(图4b)。

空肠弯曲菌增菌液在Skirrow血琼脂平板未有菌落长出。

A.E.coli O157:H7;B.Salmonella

2.3 3种食源性致病菌检出结果

大肠埃希氏菌O157:H7阳性样本数2份，检出率0.4%；沙门氏菌阳性样本数70份，检出率14.06%；空肠弯曲菌阳性样本数0。不同地区大肠埃希氏菌O157:H7和空肠弯曲菌检出结果类似，但沙门氏菌检出情况不同，惠州地区检出率明显高于清远地区。没有样本同时检出2种食源性致病菌(表2)。

表2 3种细菌检出结果

3 讨论

食源性致病菌的监测是保证食品安全的关键环节。方忠意等[11]对河南5市生猪屠宰场抽取猪盲肠内容物样品进行沙门氏菌分离，从840份样品中共分离沙门氏菌45株，分离率为5.36%。本研究中沙门氏菌的检出率较高，总检出率达到14.06%，惠州地区高达21%，清远地区也达到7.2%，说明沙门氏菌污染现象在惠州和清远地区屠宰场较为严重。洪伟彬等[12]对广东东莞畜禽肉制品(冻肉)中大肠埃希氏菌O157：H7 进行检测，其中猪肉中检出率为11.76%；朱文冠等[13]于2005年对广东地区从各地屠宰场和肉菜市场采集的样品中未检测出大肠埃希氏菌O157：H7。本研究中大肠埃希氏菌O157：H7检出率也较低，仅为0.4%，说明该菌在这批生猪的携带率较低。四川省雅安市猪肉样品中的空肠弯曲菌阳性率为28.3%[14]，青岛屠宰场采集的50份猪盲肠内容物棉拭子，分离到16株空肠弯曲菌，分离率为32%[15]。本研究498份样本中未检测出空肠弯曲菌，结合本课题组前期研究结果，连续两年对省内多家屠宰场进行监测均未检出空肠弯曲菌，说明广东地区该菌在生猪屠宰过程中的污染率较低。

作为生猪生产和猪肉流通的“连接链”，屠宰环节的微生物污染是影响畜产品质量安全的最重要因素。生猪屠宰并不是在无菌环境中进行，在进入屠宰场之前，其体表或消化道内就可能携带多种菌群，在屠宰加工过程中，也有很多不同环节可能导致细菌对鲜肉污染，例如屠宰的刀具、接触的工人、器皿以及屠宰环境等。本次检测不同菌的检出率不同可能跟各个环节都有关。我国近5年食物中毒统计资料表明，沙门氏菌食物中毒在细菌性食物中毒中居首位。多发生在食用畜禽肉、禽蛋类，此类产品含有多种营养成分，非常适宜于沙门氏菌的生长繁殖[16]。本次检测的10个屠宰场中惠州市屠宰场的检出率明显高于清远市屠宰场，其主要原因可能如下：清远市屠宰场机械化程度高，易于消毒与清洁；清远市屠宰场所用屠宰用具消毒频率高，能有效防止二次污染；清远市屠宰场在切除内脏时冲洗胴体频率更高。屠宰环节的微生物控制仍需加强，相关部门仍要加强畜禽产品加工、运输过程的卫生监管以及加强对宿主动物粪便的无害化处理监管，防止带菌动物及粪便污染以及动物产品与其他食物之间的交叉污染，增加屠宰场的机械化程度，以及屠宰用具的消毒频率，注意胴体的冲洗，保障猪肉及猪肉制品的安全，进而保障消费者的健康。