杨瑞锋，陈红松，鲁凤民

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是我国肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要病因。自20世纪90年代起我国开展HBV疫苗新生儿普种以来，我国一般人群的HBV表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性率已降到5%左右，但由于既往感染者众多，现有慢性HBV感染者仍有8 000万人[1]。目前，我国每年CHB死亡人数超过30.8万，而诊断率仅为19%，治疗率仅为10%～11%，达成世界卫生组织提出2030年“全面消除病毒性肝炎作为重大公共安全威胁”的目标仍任重而道远[2]。当前，治疗CHB以恩替卡韦(entecavir,ETV)、替诺福韦(tenofovir disoproxil fumarate,TDF)和丙酚替诺福韦(tenofovir alafenamide,TAF)等一线核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analog,NUC]为主，可强效抑制病毒复制，阻滞CHB向肝硬化和HCC发展，但在启动治疗、疗效监测及停药判定等方面，均存在一定困难或争议。

1 对HBV低病毒载量血症(low-level viremia,LLV)的关注：进一步增加对HBV DNA试剂灵敏度的要求

LLV一般定义为血清HBV DNA持续或间歇高于最低检测限(limit of detection,LOD)，同时<2 000国际单位(international unit,IU)/ml。有两种不同类型的LLV被关注，一是处于HBV感染自然病程免疫控制期的患者，即e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)阴性的非活动性HBsAg携带状态。有数据显示，处于“非活动性”携带状态的患者其HCC风险依然存在。如最近一项来自韩国的随访中位数为5.1年的回顾性研究[3]显示，代偿期肝硬化患者5年HCC发生率为13.7%(19/139)，而非肝硬化组HCC发生率也高达2.0%(17/867)。我国慢性HBV感染者基数依然庞大，并且随感染者年龄逐渐增加，肝硬化、肝癌风险逐年增高。为进一步通过抗病毒治疗减少终末期肝病及肝癌的发生，我国《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》扩大了CHB的治疗适应证[4]。降低抗病毒治疗的“门槛”，不仅仅是一个科学问题，也关乎感染者的远期健康和国家的医疗负荷。当前更多被讨论的LLV状态，则指CHB患者接受NUC治疗但未取得完全病毒学应答的情形。当今即使在接受强效NUC治疗的CHB患者中，LLV的情形也非罕见。日本Ogawa等[5]报道，经ETV治疗2年的CHB患者，仍有19.9%(38/191)处于LLV。我国Sun等[6]纳入239例CHB患者，其中163例在基线时有明显肝纤维化，经ETV治疗78周后，30%的患者仍可检测到低水平HBV DNA。NUC治疗中的LLV是预后不良的预测因素。TDF治疗78周时血清HBV DNA可检出(多在20～200 IU/ml之间)和饮酒是基线Ishak≥3分患者肝纤维化进展的两个促进因素，表明持续、低水平的HBV DNA仍会促进肝纤维化进展[6]。NUC治疗中的LLV还会增加罹患HCC的风险，韩国Kim等[7]纳入875例接受ETV单药治疗的CHB患者，随访中位数为4.5年。LLV组和持续性病毒学应答组5年进展为HCC的风险比为1.98(14.3% vs 7.5%，P=0.015)，且风险集中于肝硬化患者。当接受ETV或TDF治疗的CHB患者出现LLV时该如何处理，是当下临床关心的问题：是继续坚持治疗，还是换用或联合另一种NUC或长效干扰素；如需调整，如何确定调整的时机；调整后，病毒学应答率可提高多少；对患者的长期预后有多大改善。已有一些研究尝试回答这些问题，如Ogawa等[5]在一项多中心、回顾性队列研究中，连续纳入313例日本CHB患者，经ETV单药(n=191)或NUC联合治疗(n=122)至少2年，其中ETV治疗组34例维持LLV状态，NUC联合治疗组9例仍维持LLV状态。之后，所有受试者换为TAF治疗，48周后，ETV经治组和NUC联合经治组分别有97.1%(33/34)和77.8%(7/9)患者获得完全病毒学应答，提示换用TAF可能有助于LLV问题的解决。此外，药物用量、服药方式和患者的依从性等现实因素也可能造成间歇性LLV，也应纳入考量[8～10]。例如，有学者通过观察TDF治疗8年的CHB患者队列(n=641)，发现病毒学突破或DNA闪现(blip)事件41次，平均DNA水平1 356拷贝/ml；其中71%(29/41)与患者依从性欠佳有关，继续用药都能获得病毒学抑制，也未发现TDF相关耐药突变。Liu等[10]倾向于认为，只要TDF治疗时间足够长，LLV并不至于触发治疗方案的改变。不过，该研究受试者为欧美人群，宿主和HBV基因型与亚洲均不同。未来需要更多的前瞻性、随机双盲对照临床试验，进一步明确如何更科学地管理LLV，以及解决LLV能使患者有多少现实获益等重要问题。目前各大指南对HBV DNA检测灵敏度(或称LOD)都提出了更高要求(见表1)。目前，国内外主流的HBV DNA定量试剂灵敏度可达到1～2 log10IU/ml或以下，且结果重复性较好[11]，超敏试剂将有助于临床更早发现LLV。进一步说，病毒载量极低、接近检测试剂LOD的LLV也应引起重视。Kim等[7]认为，间歇性、极低载量LLV同样会导致不良预后。Sun等[6]发现，基线有肝纤维化、经TDF治疗的患者，即使HBV DNA“转阴”(<20 IU/ml)，仍有6.3%的患者肝纤维化出现进展。对此可能的解释是，作者使用的LOD和线性范围低限均为20 IU/ml，灵敏度仍未达到美国肝病学会(AASLD)推荐的检测灵敏度(5～10 IU/ml)，且研究者没有区分HBV DNA“未检测到”和“<20 IU/ml”线性检测下限两种结果模式，后者表示有PCR扩增曲线、仍有痕量DNA存在，只是无法准确定量(见图1)。这样一来，那些被判断为DNA“阴性”的肝纤维化进展患者，实际上外周血可能仍存在痕量HBV DNA，即处于极低病毒载量的LLV状态。据此我们建议，在LLV日益引起关注的当下，检验报告应增加对超敏HBV DNA试剂各种结果模式的备注，以帮助临床医师，尤其肝病科医师，清楚辨析这些复杂的结果模式(见图1)。从检验方法学角度分析，LLV风险和危害被不断强调的当下，临床诊治对HBV DNA检测下限的要求似乎“进无止境”，但我们究竟需要多么灵敏的HBV DNA检测试剂？最近一项来自欧洲的献血者和受血者的随访研究证实，抗-HBc阳性的隐匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)的献血者血液中含有0.15 IU/ml的HBV DNA，即可导致受血者感染[12]，而当前主流的HBV DNA定性或定量试剂，都远远达不到这个灵敏度要求。借鉴到临床肝病诊治的实践中，我们还需待进一步明确极低病毒载量HBV感染者的自然转归，以及通过更强效NUC治疗方案解决LLV后患者的真实获益。此外，片面强调试剂的灵敏度会导致污染产生的低值阳性结果被误当做LLV，从而给CHB的诊治带来困扰。PCR产物污染像一把悬于核酸检测实验室的“达摩克利剑”——一次充分反应的PCR可产生多达1012拷贝的DNA片段，将其投入标准的奥林匹克游泳池稀释，再从中取出和反应体系相同体积的水，其中仍含有400拷贝的DNA片段，足以伪装成LLV的假象[13]。面对LLV结果，应从临床和检验方法学两个角度辩证看待，如有必要，需动态监测(见图2)。此外，我们还需认识到，大部分国产试剂属于开放性试剂，可灵活适应于不同的核酸提取平台和PCR仪。但由此产生的问题是，操作过程及结果分析等步骤，易受操作者主观因素影响，结果偏倚较大，这是既往报道的、国产试剂和进口封闭性试剂性能有差距的重要原因。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染疫情客观上促进了核酸检测人员的培养和场地、设备在医疗机构的完善，全自动、封闭式的提取和扩增平台以及结果自动定量算法的建立[14]，都可进一步减轻操作负担，减少人为干扰，提高检测灵敏度、准确度和重复性，应成为未来几年国产核酸检测的发展方向。

表1 最新指南中对HBV DNA检测灵敏度的要求

图1 超敏HBV DNA定量结果报告模式及对应的解释

图2 从临床和检验方法学角度科学解读和管理间歇性LLV

2 预测NUC治疗停药：HBV pgRNA有潜在价值

近年来，我国NUC药品价格迅速降低，大大减轻了CHB患者长期服药的经济负担，但长期服药仍面临药物副作用、依从性、精神压力等挑战。各指南均推荐了NUC停药标准(见表2)。HBsAg的消失和(或)血清学转换是CHB功能性治愈的可靠标志，但现有治疗方案仅能使少数患者达到这一“理想终点”，因此HBsAg作为预测停药标志物，受众有限。近年来，新标志物如HBV前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)和核心相关抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)等被陆续报道用于预测NUC治疗停药。……