田 力，徐骋炜，尚旭岚，洑香香

(南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)又名青钱李、摇钱树等，系胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)植物，是中国特有的单种属植物。青钱柳是传统的清热解毒中药材，在《中药辞海》《中药大辞典》中都有记载。现代研究发现青钱柳叶片内含有独特的生物活性物质，具有重要的医药和保健价值。青钱柳叶片中总黄酮、总三萜和水溶性多糖等生物活性物质，能明显降低血糖、尿糖，还具有防癌、抗肿瘤的功效[1-3]。民间常在春季(3—5月)采摘嫩叶制茶[4]，茶味口感清新甜爽；秋季(9—10月)则是叶片主要生物活性物质积累和叶生物量最高的季节[5-7]，常用作制药提取原料。

药用植物主要生物活性物质的含量和活性在种源间、家系间和个体间均存在显著差异。如厚朴(Magnoliaofficinaalis)的酚含量在种源间的差异高达8倍[8]；黄芩(Scutellariabaicalensis)的黄芩苷含量种源间具有显著差异，黄芩素含量的变异达到极显著水平[9]。银杏(Gingkobiloba)不同种源叶片的内酯含量也存显著差异[10]。在家系水平上，铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)的多糖和总黄酮含量均差异显著[11]。东北红豆杉(Taxuscuspidata)不同单株间的紫杉醇含量差异高达4.3倍[12]。对青钱柳的研究也表明，叶片总黄酮在种源、家系和个体间均存在显著差异，家系间的含量均值相差1.81倍，且家系水平上的差异大于种源间的差异[13-14]。青钱柳叶片黄酮类物质也存在明显的地理变异，纬度变异大于经度变异[15]。另外，青钱柳叶中的酚类物质在种源间也存在显著差异，酚类物质在体外的抗氧化活性属湖北五峰种源最高[16]。

植物体内的生物活性物质常与表型密切相关。如叶色与类黄酮的组成和积累量显著相关[17-18]；有些表型则影响了叶生物量(叶产量)，如叶面积大小、叶形等[19]；而有的表型间接地改变了栽培植株的微环境，从而引起生物活性物质的含量变化，如分枝角和冠型[20]。所以可利用植物的叶片、枝条和根系等表型性状来进行优株的初步选择[21-22]。

笔者通过多年对青钱柳种质资源库的观测发现，植株表型存在丰富的变异：如嫩叶叶色有红色、淡粉红色和黄绿色等变异；叶面积的大小变异达2倍以上；叶形有卷曲和平展之分；Ⅰ级侧枝的分枝角变异从30°到60°，从而形成不同的冠型(紧凑型、开张型和扁平型)。

本研究在第1轮表型性状选择的基础上，测定了叶片中主要生物活性物质的含量，通过第2轮单指标和多指标选择和对优选单株生物活性物质含量年度间稳定性的观察，为选育生物活性物质含量高、年度间稳定性好的青钱柳药用新品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 候选林分概况

候选林分为6年生，已进入大规模采叶期的人工林，2015年种植于安徽池州市石台县青钱柳试验基地(117°17′E,30°14′N)，面积约40 hm2。试验材料收集了张家界、井冈山、五峰、沐川、浙江千岛湖等地青钱柳自然分布区的不同种源，栽植密度为2.0 m×2.0 m。

该地属中亚热带湿润季风气候区，处于黄山、九华山余脉与长江交汇带，土壤呈微碱性；历年平均气温16 ℃、最高气温40.8 ℃、最低气温-8.5 ℃，全年无霜期233 d，年均日照时间为1 702 h，年均降雨量1 350～1 800 mm，是青钱柳的自然分布区之一。

1.2 优良单株的选择

1.2.1 第1轮选择

在前期优良种源性状的基础上，2017年3月底幼叶展开后进行优良单株的第1轮选择。选择标准主要基于植株的叶(叶色、叶形、叶面积大小)和树型(分枝角和冠型)等性状，初步入选优株逐一编号、标记和登记，具体指标如下。

叶片：嫩叶叶色(LC)以红色为入选标准，以绿色为对照；叶面积大小(LS)，以叶面积为常规叶面积的1.5～2.0倍为入选标准；叶片平展程度(LF)，以叶面卷曲为入选标准。

树型：Ⅰ级侧枝与主干的分枝角(BA)>45°为选择标准；冠型以树形饱满的卵圆形(CR，所有Ⅰ级侧枝均匀分布主干四周)和树形平展的扁平型(CP，所有Ⅰ级侧枝处于1个平面上)为入选标准。

对照植株表型为青钱柳常见叶和树形特征：嫩叶黄绿色、常规叶大小和叶面平展；分枝角30°～45°，冠型卵圆形。

分别测定初选优株的叶片总黄酮、总三萜和水溶性多糖等生物活性物质的含量，预测改良潜力。改良潜力代表在育种过程中可以把相应指标含量提高的潜力[23]，计算公式为：

1.2.2 第2轮选择

于2017年9月底采收初选优株叶片，选取向阳面中上部完全展开的功能叶(一般位于枝条顶芽下部第4～6个复叶中部的小叶)，在不同枝条上采收5～8片复叶。将采集的叶片置于60 ℃的烘箱中干燥48 h，烘至质量恒定后粉碎，过200目(44 μm孔径)筛，将粉末干燥保存备用。

叶片主要生物活性物质(包括总黄酮、总三萜和水溶性多糖)含量的测定方法参考Wen等[24]、Fu等[25]和Fan等[26]的方法。

第2轮单指标选择标准：某种活性物质含量高于平均值为Ⅱ级优树，高于平均值一个标准差的为Ⅰ级优树。

第2轮多指标选择采用模糊数学中隶属函数的方法，综合比较叶片的生物活性物质，即对3种生物活性物质分别求隶属值，平均后得其综合隶属值。以综合隶属值高于平均综合隶属值50%为选择标准。

隶属值计算公式为：

隶属值=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)×100%;

综合隶属值=(X1+X2+X3)/3。

式中：X为某一指标测定值，Xmax为该指标所有测定值的最大值，Xmin为该指标所有测定值的最小值；

X1为总黄酮隶属值，X2为总三萜隶属值，X3为水溶性多糖隶属值。

1.3 稳定性评价和决选

翌年(2018年9月)采收按第2轮单指标和多项指标选择入选优树叶片，测定其主要生物活性物质含量。通过年度间比较评价叶片生物活性物质含量的稳定性，终选出性状稳定的优树。

1.4 数据分析

数据处理采用Excel 2010和SPSS 19.0进行统计再综合分析。对各指标进行单因素方差分析和Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 优良单株的第1轮选择

根据第1轮选择标准，选出36株优良单株。其中基于优良种源的分析[5]，选出生物活性物质含量高的优株3株，根据表型性状选出优株30株，及3株对照植株。优良单株编号、来源及具体的形态特征见表1。

表1 青钱柳第1轮选择优株的基本信息

表1(续)

2.2 优良单株的第2轮选择

2.2.1 初选优株叶片主要生物活性物质的比较

方差分析表明，第1轮选择出的36个优株叶片3种生物活性物质含量存在极显著差异(P<0.01，表2)。总黄酮含量变幅为16.91～34.62 mg/g，均值为25.78 mg/g；其中LC1含量最高，是最小含量LS3的2.05倍，比均值高出34.3%。总三萜含量的变幅为14.97～30.12 mg/g，均值为21.00 mg/g；其中CR6含量最高，是最小含量CP7的2倍，而比均值高出43.4%。水溶性多糖含量为17.21～29.26 mg/g，其中CR3最高，是最小值CK中含量的1.7倍，比均值高出36.41%。

表2 青钱柳药用优株叶片主要生物活性物质的含量比较

由表2可知，33个优株的总黄酮、总三萜和水溶性多糖的平均含量分别为25.90、21.24和21.52 mg/g，分别比CK均值高5.9%、15.6%和3.8%。总黄酮、总三萜和水溶性多糖改良潜力分别为34.30%、43.43%和36.41%。由此可见，以表型性状为选择依据可选择到总三萜含量高的优株，总黄酮和水溶性多糖提高的幅度较小。

2.2.2 单指标选择

根据当年9月总黄酮、总三萜和水溶性多糖的含量，对33个优株进行单指标选择，含量高于平均值为Ⅱ级优树标准，含量高于平均值加一个标准差为Ⅰ级优树标准。

从单指标选择结果(表3)可知，以总黄酮含量为选优目标，选出Ⅱ级优树14株(入选率42.4%)，均值为27.67 mg/g，比未入选单株均值高出24.1%；选出5株Ⅰ级优树，分别是LC1、LC4、LC5、LF2和CP3(入选率15.2%)，均值为32.40 mg/g，比未入选单株均值高出45.4%。以总三萜为选优目标，选出Ⅱ级优树12株(入选率36.4%)，均值为22.72 mg/g，比未入选单株均值高出26.0%；选出5株Ⅰ级优树，分别是CR6、CP3、LC2、LC4和CP1(入选率15.2%)，均值为25.34 mg/g，比未入选单株均值高出56.2%。以水溶性多糖为选优目标，选出Ⅱ级优树12株(入选率36.4%)，均值为22.52 mg/g，比未入选单株均值高出17.4%；选出7株Ⅰ级优树，分别是CR3、LF3、CR2、CR6、LC4、LF4和LS2(入选率21.2%)，均值为25.13 mg/g，比未入选单株均值高出31.0%。

表3 基于叶主要生物活性物质进行单指标选择的青钱柳药用优株

2.2.3 多指标选择

通过对叶总黄酮、总三萜和水溶性多糖隶属函数分析，获得了排名前10的综合隶属函数值(表4)。由表4可知，入选单株LC4的综合隶属函数值最高、LC2最低，分别为76.84%、49.37%。

表4 基于多指标选择的青钱柳高含量生物活性物质优株的综合隶属函数

对照表3，多指标选择排名前10的植株均在单指标选择Ⅰ级入选范围内。其中，4株(LC1、LC4、LC5和CP3)为高黄酮含量、4株(LC4、CP3、LC2和CR6)为高三萜含量和6株(CR3、LF3、CR2、CR6、LC4和LS2)为高多糖含量。

2.3 优株年度含量稳定性评价及决选

为了选出表达稳定的优株，在2018年9月对多指标优选排名前10的前4位和后3位(共7株)、单指标Ⅱ级的部分优株(4株)及未入选部分植株(3株)，进行主要活性物质的测定，并将测定结果与2017年含量进行比较后确定决选植株(表5)。

由表5可知，两个年度间除水溶性多糖外，总黄酮和总三萜均值从大到小均依次为多指标选择优株、单指标Ⅱ级优株、未入选植株，说明多指标优选方法是可行的。比较年度间各成分含量的稳定性，大部分入选单株年度间不同组分的含量波动较大，最高可达50%，如CP3和CR6中的总三萜含量；同时，2018年大部分生物活性物质的含量低于2017年的测定值。由此可见，青钱柳叶片主要生物活性物质的含量除了受个体基因型的控制以外，环境因素的影响也较大。

表5 青钱柳叶主要生物活性物质含量的年度稳定性评价

因此，药用青钱柳的选优，需要尽量排除环境干扰的影响，选出生物活性物质含量稳定的基因型。稳定性分析结果表明，青钱柳优树的决选，除了生物活性物质多指标综合考虑，中选单株活性组分的年度相对稳定性也是必须考虑的。通过综合评价，从第2轮选择出的优树中决选出编号为LC1、LC4和CP3的3单株。

2.4 植株表型变异与生物活性物质含量相关性检验

为了评价青钱柳表型选择的效果，分析了基于不同表型性状的叶主要活性物质含量并进行相关显著性检验，结果见表6。

由表6可知，嫩叶红色性状与总黄酮和总三萜含量呈极显著相关，其均值分别比CK高出23.42%和32.77%。其次，冠形饱满、分枝角大的植株与总三萜含量也分别呈显著和极显著的正相关，均值分别比CK提高15.24%和24.33%。基于表型性状入选的其他单株的叶片活性物质含量平均值，都未达到统计显著水平。由此可见，嫩叶红色、分枝角大和冠型饱满可作为青钱柳药用优株的第1轮选择标准。

表6 不同表型性状青钱柳优株叶片生物活性物质的含量及其相关性检验

3 讨 论

我国对于林源中药原料植物挖掘和利用具有悠久的历史。但传统的中药采收和制备，更多注重原药材的“地道性”和“原生性”，即更多注重药用植物(药材)的药效(质)。但地道性优质药材受到产量的局限，远远不能满足中药市场的需要。优质地道性中药材品种选育和定向栽培逐渐成为林源药材发展的重要发展方向，并取得了重要进展。如厚朴树皮中的厚朴酚高含量的种源和家系选择[8]、南方红豆杉(Taxuswallichiana)根和树皮中的紫杉醇和枝叶中的紫杉醇半合成前体巴卡亭-Ⅲ和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ组分的资源选择[27]、及用于农药原料印楝(Azadirachtaindica)种子印楝素A和B含量的种源选择[28]。药用植物中的有效成分与表型性状相关的间接选择也受到重视。如发现了厚朴酚的含量与厚朴叶型的显著相关性[8]、三七(Panaxontoginseng)的叶面积对根质量的贡献[29]、叶色与叶片黄酮含量的高低有关[17-18]。这些表型性状可作为间接选择的重要参考。但更多情况下，药用植物生物活性物质与表型的相关性受到栽培环境的变化而缺乏规律，从而给药用植物的地道性和以生物活性物质为目标的品种培育带来了困难。

但不同药用植物种以及种内不同种源、林分和家系间的生物活性成分高低以及与表型性状的相关性，也存在显著的遗传变异和受遗传与环境的互作影响。方升佐等[30]、林源等[32]发现，青钱柳叶片中生物活性物质的主要成分是三萜、黄酮和水溶性多糖。洑香香等[25]发现不同叶色的青钱柳基因型黄酮含量的变异，以及侧枝与主干的分枝角影响树冠形状与结构，造成了不同位置(植株上、中和下部)叶受光不同，从而影响到生物活性物质的积累。其他研究结果表明，不同树冠结构的表型影响到单位面积叶片总的生物量[32]。本研究发现，青钱柳新梢嫩叶呈红色与总黄酮、总三萜的含量呈极显著相关，而分枝角度大小则与总三萜含量呈极显著相关；具有饱满冠型的植株不仅与叶片总三萜含量显著相关，还预示了叶片总生物量的增加。

由于林源药用植物的有效成分和含量同时受到基因型和环境的影响，有效生物活性物质的有效成分(次生代谢物)和含量的年度稳定性下的早期和间接选择效率显得尤为重要。因此，药用青钱柳新品种选育时，将单指标选择和多指标选择、年度稳定性评价结合起来，是提高青钱柳药用或保健用生物活性物质育种的有效策略。本研究采用这种策略，从第1轮选择出的36株材料中经过第2轮筛选出10个优良单株，并进一步结合生物活性物质含量年度间的稳定性，决选出3优株，编号分别为LC1、LC4和CP3，入选率为9.0%。初步研究结果表明，青钱柳药用优株的选择可以嫩叶红色、大分枝角为首要选择指标，辅以饱满的冠型，可以作为青钱柳以次生代谢物为主的生物活性物质育种材料选择的重要依据。生物活性物质有效成分含量和总生物量增加的选育目标，对于林源中药或保健产品的现代化加工利用产业化，具有重要意义。同时，中选材料为下一步的育种和栽培模式研究，提供了重要的材料基础。

但是，本优选的原始材料虽然来自青钱柳的主要栽培区，但材料表现和稳定性测定仅局限于安徽石台栽培点的两个年度的初步结果。选择材料的无性系化和多点多年度的稳定评价等重要科学问题，有待进一步深入研究。