李 娜，朱培林，丰 采，温敏学，方升佐，尚旭岚*

(1.南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.江西省林业科学院，江西 南昌 330032；3. 江西省益森实业有限公司，江西 宜春 336000)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)，又名麻柳、一串钱、金钱柳，系胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属，是我国特有的单种属植物[1]。青钱柳是一种药食同源的植物资源，长期以来民间冲泡其叶片作茶饮[2]。研究发现青钱柳叶含大量生物活性物质，有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化等药用价值，具有良好的开发利用前景[3-6]。但青钱柳雌雄异型异熟的开花特性，造成种子饱满度低、种子发育差，并具有深休眠特性，扦插繁殖成活率低，难以满足大量人工栽培的种苗需求[7]。嫁接技术在植物优良性状保持和快速扩繁等方面具有重要的应用价值[8]，生产上常采用同种作为砧木，但青钱柳本砧培育时间长、经济成本高，选择与青钱柳具有高亲和性和低经济成本的异种植物作为砧木极有必要。已有研究表明，嫁接后接穗和砧木营养贮藏物质、防御酶活性以及酚类物质含量等的生理变化，在一定程度上能够反映嫁接亲和性强弱[9-11]。同时，严毅[12]和石雪晖等[13]研究发现，砧穗的营养物质和酶活性的差值绝对值的大小，与砧穗的生理适应程度有关，可以作为砧穗组合亲和性的判断指标。目前张燕等[14]已探讨青钱柳不同砧穗组合和嫁接方法对嫁接成活率的影响，但至今对青钱柳嫁接愈合过程中的生理特性变化与亲和性关系的研究尚鲜见报道。因此，笔者以胡桃科的枫杨属、山核桃属和青钱柳属3个树种为砧木进行青钱柳嫁接，通过比较不同嫁接组合接穗和砧木生理指标的差异，探讨生理特性与嫁接成活的关系，为青钱柳砧穗嫁接亲和性的早期预测和砧木选择奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试验地概况

以南京林业大学青钱柳种质资源库多年生青钱柳为采穗母树，选取1年生健壮的枝条作为接穗材料，以2年生青钱柳、枫杨(Pterocaryastenoptera)和薄壳山核桃(Caryaillinoinensis)实生容器苗为砧木，于2018年2月在南京林业大学白马教学科研基地(119°09′E，31°35′N)进行嫁接试验。基地位于江苏省南京市溧水区白马镇，属于北亚热带向中亚热带的过渡区，年均气温15.4 ℃，全年无霜期237 d，年均日照时间2 240 h，年均降雨量1 087.4 mm。

1.2 试验设计

嫁接试验于2018年2月下旬进行，采用切接的方法进行嫁接，选取无病虫害的1年生完全木质化枝条为接穗，每个接穗留1个芽，接穗背芽方削成一个长3～5 cm的大斜面，斜面面积超过髓心，削去向芽方的外皮。选直径为1～2 cm的苗木为砧木，距根颈10～15 cm处截断，沿木质部和韧皮部之间纵切，切口长度与接穗削面相同。将接穗插入砧木切口中，露白0.5 cm，最后用薄膜条绑扎，芽露在外面。

设计青钱柳-青钱柳(QQ，对照组)、青钱柳-枫杨(QF)和青钱柳-薄壳山核桃(QB)3种嫁接组合，根据青钱柳、枫杨和薄壳山核桃现有实生容器苗的数量，3个组合分别选取嫁接苗110株(QQ)、40株(QF)和45株(QB)，采用完全随机区组设计，3次重复，于70 d时统计不同嫁接组合嫁接成活状况，以接穗芽萌动作为判断嫁接成活的标准。同时，每种组合各嫁接200株用于取样，测定嫁接后0、40 和70 d的相关生理指标。嫁接当日，每个组合各取5株嫁接苗，截取嫁接处5 cm长茎段，分别剥取接穗与砧木韧皮，再分别装袋放入液氮中带回实验室，随后保存在-80 ℃超低温冰箱中。40 和70 d均选择接穗芽萌动或已长成新梢的植株进行取样，其他操作同上。每个组合每次均取3个平行样。

1.3 测定方法

可溶性糖、可溶性蛋白和淀粉含量和过氧化物酶(POD)活性的测定参照李合生[15]的方法，多酚氧化酶(PPO)活性的测定参照张晓等[16]的方法，单宁含量测定参照韩卫娟等[17]的方法。POD和PPO酶活单位U为每min吸光度变化0.01所需酶量。

1.4 数据处理

采用单因素方差分析方法比较各嫁接组合接穗或砧木不同时期的生理指标和嫁接成活率的差异，并用Duncan’s新复极差法分析处理间的差异显著性；以独立样本t检验比较各嫁接组合同一时期接穗和砧木的差异，以Pearson相关模型分析生理指标和嫁接成活率的关系。接穗与砧木的差值绝对值=|接穗指标-砧木指标|。数据统计分析均采用SPSS 22.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同嫁接组合嫁接成活率的差异

成活率是判断砧穗嫁接亲和性的主要指标。方差分析结果表明，不同嫁接组合的嫁接成活率存在显著差异(P<0.05，图1)。嫁接后70 d，QQ组合的成活率为53.49%，显著高于QF和QB组合的成活率，但QF和QB组合间成活率无显著差异，表明青钱柳本砧嫁接的亲和性显著高于异种嫁接。

QQ代表青钱柳-青钱柳嫁接组合，QF代表青钱柳-枫杨嫁接组合，QB代表青钱柳-薄壳山核桃嫁接组合。下同。不同字母表示同一时间嫁接组合成活率差异显著(P<0.05)。QQ indicate the grafting combination of C. paliurus and C. paliurus, QF indicate the grafing combination of C. paliurus and P. stenoptera, and QB indicate the grafing combination of C. paliurus and C. illinoinensis. The same below. Different letters indicate the significant difference of survival rates grafting at various grafting combinations at the same time(P<0.05).图1 不同嫁接组合青钱柳嫁接成活率的差异Fig.1 Variations in the grafting survival rate of C. paliurus at various grafting combinations

2.2 不同嫁接组合接穗和砧木代谢物质含量的差异

2.2.1 可溶性糖和可溶性蛋白含量

嫁接后随着时间的延长，QQ组合接穗与砧木可溶性糖含量呈先降后升的变化规律，而QF和QB组合砧木可溶性糖含量均呈现上升趋势(表1)。嫁接后40 d，QQ组合接穗和砧木可溶性糖含量分别比嫁接当天(0 d)降低32.80%和15.87%。QF和QB组合接穗可溶性糖含量的变化幅度小，分别比嫁接当天降低8.38%和4.74%，而砧木可溶性糖含量分别是嫁接当天的109.43%和176.92%。QQ和QB组合的接穗与砧木间可溶性糖含量均存在显著差异(P<0.05)，其接穗与砧木的差值绝对值分别为0.32%和0.55%。嫁按后70 d时，3个嫁接组合中，QB组合的接穗与砧木的可溶性糖含量均最高，分别是QQ组合接穗与砧木的可溶性糖含量的155.45%和166.36%。70 d 时，QQ、QF和QB组合接穗和砧木间可溶性糖含量均不存在显著差异(表1)。

表1 不同嫁接组合接穗和砧木中可溶性糖和可溶性蛋白含量的差异

嫁接后随着生长时间的延长，QQ、QF和QB组合接穗的可溶性蛋白含量均呈现上升趋势，而3个组合砧木的可溶性蛋白含量均先升后降(表1)。嫁接后40 d，3个组合接穗和砧木的可溶性蛋白含量均较嫁接当日有显著升高，QQ组合砧木的可溶性蛋白含量升高幅度最大，为42.29%，而QF组合砧木的可溶性蛋白含量比嫁接当天仅升高29.77%。QQ组合接穗与砧木间可溶性蛋白含量存在显著差异(P<0.05)，其差值绝对值为0.98%。70 d时，QQ组合砧木的可溶性蛋白含量较40 d时显著降低，而3个组合接穗的可溶性蛋白含量在两个时段变化不显著。70 d时，QQ组合砧穗的差值绝对值为40 d时的2.04%，而QF组合则比40 d时升高了400%。

2.2.2 淀粉和单宁含量

嫁接后随着生长时间的延长，QQ组合接穗与砧木淀粉含量均呈先降后升趋势，QF和QB组合砧木的淀粉含量也表现为先降后升趋势，但两种组合接穗的淀粉含量则表现为上升趋势(表2)。40 d时，QQ组合接穗与砧木淀粉含量分别比嫁接当天(0 d)降低24.46%和25.90%，QF和QB组合砧木的淀粉含量变化幅度较小，分别比嫁接当天降低3.68%和12.76%，而接穗的淀粉含量分别比嫁接当天升高了10.07%和27.34%。40 d时，3个组合中仅QB砧穗间淀粉含量存在显著差异(P<0.05)，差值绝对值达0.35%，而QQ组合砧穗淀粉含量的差值绝对值仅为0.02%。70 d时，QQ、QF和QB组合的接穗与砧木间淀粉含量均存在显著差异(P<0.05)，砧穗淀粉含量的差值绝对值分别为0.71%、0.62%和1.70%，均比40 d砧穗差值有所升高。

表2 不同嫁接组合接穗和砧木中淀粉和单宁含量的差异

嫁接后随着生长时间的延长，QQ、QF和QB组合接穗与砧木的单宁含量均表现为先升后降趋势(表2)。40 d时，3个组合接穗和砧木的单宁含量均较嫁接当日有显著升高，QB组合的砧木与接穗的单宁含量分别比嫁接当天升高100%和80.86%，而QQ组合的变化幅度最小，仅比嫁接当天升高31.25%和36.97%。40 d时，QB组合的接穗与砧木间单宁含量存在显著差异(P<0.05)，差值绝对值为0.67%。70 d时，QB组合砧木的单宁含量最高，为QQ组合砧木的1.55倍。70 d时，QF组合接穗与砧木间单宁含量存在显著差异(P<0.05)，其砧穗差值绝对值为0.44%，较40 d升高了340%，而QQ砧穗间单宁含量的差值绝对值最小，较40 d时仅提高了25%。

2.3 不同嫁接组合接穗和砧木氧化酶活性的差异

嫁接后随着生长时间的延长，QQ、QF和QB组合接穗与砧木的POD活性均先升后降(表3)。40 d时，QQ组合接穗和砧木的POD活性最高，分别是嫁接当天的309.34%和480.22%，QB组合接穗和砧木的POD活性变化幅度最小，分别是嫁接当天的180.77%和116.06%。40 d时，QQ、QF和QB组合接穗与砧木间POD活性均存在显著差异(P<0.05)，砧穗POD活性差值绝对值分别为62.20、31.30 和74.40 U/g。70 d时，3个嫁接组合砧穗POD活性的差值绝对值相较40 d时小，分别降低到3.30、7.90和19.60 U/g，其中，QF和QB组合接穗与砧木间POD活性存在显著差异(P<0.05)。

嫁接后随着生长时间的延长，QQ组合接穗与砧木的PPO活性先降后升，QF和QB组合接穗与砧木的PPO活性在嫁接愈合过程中持续升高(表3)。40 d时，QQ 组合接穗和砧木的PPO活性均最低，与嫁接当天相较，分别降低34.12%和25.59%，而QB组合接穗和砧木的PPO活性与嫁接当天相较分别升高63.03%和88.26%。40 d时，QQ、QF和QB组合砧穗PPO活性的差值绝对值分别为0.90、3.00和4.45 U/g，仅QB组合接穗与砧木间PPO活性存在显著差异(P<0.05)。70 d时，QQ组合接穗和砧木的PPO活性变幅最大，比40 d时分别升高146.04%和79.62%，而QF组合接穗和砧木PPO活性变幅较小，较40 d时分别升高16.49%和25.78%。70 d时，QQ、QF和QB组合砧穗间PPO活性差异均不显著。

表3 不同嫁接组合接穗和砧木中POD和PPO活性的差异

2.4 不同砧穗组合成活率与生理指标的关系

由嫁接成活率与不同时期接穗、砧木生理指标的相关性分析(表4)可知，同一时期，接穗和砧木的生理指标与嫁接成活率的相关性一致，但不同时期，接穗和砧木的生理指标与嫁接成活率的相关性存在一定差异。嫁接后40 d，接穗和砧木的可溶性糖、淀粉和单宁含量及PPO活性均与嫁接成活率显著负相关(P<0.05)，POD活性与嫁接成活率显著正相关(P<0.05)；嫁接70 d后，接穗和砧木中的可溶性糖和单宁含量及PPO活性与嫁接成活率显著负相关(P<0.05)，而接穗POD活性与嫁接成活率显著正相关(P<0.05)。

为了综合说明不同时期嫁接体代谢物质含量及氧化酶活性与嫁接成活率的关系，分别以嫁接40和70 d的接穗与砧木的代谢物质及氧化酶活性的差值绝对值与嫁接成活率进行了相关分析，结果表明，40 d时接穗与砧木的PPO活性差值绝对值与嫁接成活率显著负相关(P<0.05)；而70 d时接穗与砧木的POD活性差值绝对值与嫁接成活率显著负相关(P<0.05，表4)。

表4 嫁接成活率与不同时期接穗、砧木生理指标的相关性分析(n=9)

3 讨 论

3.1 嫁接成活率

亲和嫁接是指砧木和接穗可以完全或部分愈合成为共生体，并能长期生长和结实，砧木和接穗在分类学上关系越近，其嫁接亲和性越好[18]。有研究表明，枫杨属与青钱柳属的亲缘关系相对较近，山核桃属与青钱柳属的亲缘关系较远[19-20]。本研究中，QQ组合嫁接70 d时的成活率为53.49%，显著高于QF和QB组合的成活率(P<0.05)；QF组合成活率较QB组合高7.35%，这可能是由于青钱柳与枫杨的亲缘关系较之与薄壳山核桃的近，因此其亲和性在嫁接早期表现得略强。但随着时间的延长，以枫杨和薄壳山核桃为砧木嫁接的青钱柳均表现长势逐渐衰弱干枯等后期不亲和现象，嫁接300 d时成活率均为0。而对本砧嫁接组合的观察发现，70 d时砧穗已完全愈合，接穗已有2～3片复叶完全展开，新梢生长旺盛，嫁接300 d时成活率仅略有降低(为50.87%)。

3.2 代谢物质

植物的生长发育是植物体各种代谢活动的综合体现，通过早期的生理变化可预测未来的生长表现。

在嫁接愈合过程中，不同的阶段会产生相应的生理响应调节接口的分化和愈合，以维持植物正常生长[21-22]。很多研究表明，嫁接愈合初期不仅需要碳水化合物作为信号物质启动砧穗间物质交流，还需要消耗大量的营养物质为新组织的构建提供足够的能量[23-24]，王瑞等[25]对油茶嫁接愈合过程的研究发现，在输导组织分化前砧穗中的可溶性糖含量均呈下降趋势。本研究结果表明，QQ组合砧木和接穗的可溶性糖和淀粉含量随时间均表现为先降低后升高，而QF和QB组合砧木的可溶性糖和淀粉含量却呈现持续升高，这说明嫁接愈合更快更好的QQ组合其可溶性糖和淀粉能被顺利运输，并被植物消耗分解，因此表现为初期降低；而不亲和的嫁接组合其营养物质运输受阻，在结合部积累，则表现为升高[26-27]。相关性分析结果也表明，40和70 d时接穗、砧木的可溶性糖和淀粉含量与嫁接成活率呈负相关关系(P<0.05)，因此，可溶性糖和淀粉含量的变化可用于青钱柳早期嫁接亲和性的预测。可溶性蛋白作为营养物质，在青钱柳嫁接愈合过程中与成活率未见显著相关性，但本研究中3个组合的砧木可溶性蛋白含量呈现先升高后降低的趋势，这与孙华丽等[28]和魏菊等[29]的研究结果一致。

单宁是一种多酚类化合物，通过影响IAA合成及运输，进而影响形成层发育和维管束分化[30]，苏文川[31]认为单宁与隔离层的形成有关，嫁接体内单宁含量较高致使隔离层扩增，阻碍砧穗间水分养料及信号分子的交流。Usenik等[32]的研究表明，嫁接口上下积累较多酚类物质不利于砧穗愈合。本试验中3个嫁接组合接穗和砧木的单宁含量随时间均表现为先升后降，这是由于植物受到伤害时，其体内单宁大量积累，随着嫁接体渐渐愈合，单宁含量逐步下降[31]。通过比较3个组合接穗与砧木的单宁含量可以发现，QB组合均最高，而QQ组合均最低，这与各组合嫁接成活率正好相反。相关分析结果也表明，40和70 d时接穗、砧木的单宁含量与嫁接成活率呈负相关关系(P<0.05)，因此，单宁含量的变化也可作为青钱柳早期嫁接亲和性鉴定的指标。

3.3 氧化酶活性

POD在嫁接愈合过程中不仅是非生物胁迫的应激产物，同时可以沉积木质素，促进维管组织的木质化[33-34]。因此，嫁接初期植物体常表现为POD活性增加，以抵御因嫁接创伤产生的过氧化氢，从而促进伤口愈合[35-36]，之后POD还会参与嫁接体细胞中的木质素合成催化木质素单体脱氢聚合反应[37-38]。严毅[12]研究还发现，葡萄柚嫁接砧穗愈伤组织POD、PPO等酶的活性差值绝对值越接近，愈合越好。杨瑞[39]也发现，葡萄砧穗叶片中的POD、PPO活性差值绝对值越小，嫁接亲和力就越强。本研究中QQ、QF和QB组合接穗与砧木POD活性均表现为先升后降，这与魏菊等[29]的研究结果一致。其中，QQ组合接穗的POD活性在两个时段均高于其他两个组合，70 d时QQ组合接穗与砧木的POD活性差值绝对值最小。相关性分析结果表明，嫁接后40 d，砧木和接穗的POD活性与嫁接成活率均呈正相关关系(P<0.05)，70 d时，接穗的POD活性与嫁接成活率呈正相关关系(P<0.05)，70 d时接穗与砧木的POD活性差值绝对值与嫁接成活率则呈显著负相关关系(P<0.05)，因此，砧穗POD活性的变化以及70 d时砧穗的绝对差值可作为青钱柳嫁接亲和性鉴定的早期预选指标。PPO广泛存在于植物组织中，通过形成醌类化合物构成保护性屏障而使细胞免受病菌的侵害，同时，PPO也参与木质素的形成[40]。嫁接愈合初期，PPO将砧穗接合部的酚类氧化成活性醌，醌聚集形成黑色和褐色的隔离层；有研究表明，嫁接后PPO活性一般为先上升后下降[29,41]，通常在不亲和嫁接组合中PPO活性高且持续时间长[42-43]。本研究中，QF和QB组合接穗与砧木的PPO活性在嫁接愈合过程中持续升高，这与两个组合嫁接后单宁含量一直保持较高水平相一致。而QQ组合PPO活性在40 d时降低而后再上升，这可能是由于本砧组合嫁接40 d时砧穗间隔离层消失，已进入接穗和砧木愈伤组织形成时期，故此时PPO活性表现为降低，这与其较低的单宁含量表现一致。随着QQ组合愈伤组织的分裂、增殖和连接，砧穗之间愈伤组织会形成维管束桥，而木质素是嫁接口维管组织分化的前提[44]，PPO参与木质素的形成，故本砧嫁接70 d时PPO活性反而高于40 d。相关分析结果表明，整个嫁接愈合过程，砧穗的PPO活性与嫁接成活率均呈显著负相关关系(P<0.05)，嫁接40 d时接穗与砧木的PPO活性差值绝对值与嫁接成活率则呈显著负相关关系(P< 0.05)。因此，也可把砧穗PPO活性的变化和40 d时砧穗PPO活性的绝对差值作为青钱柳嫁接亲和性鉴定的早期预选指标。

结合嫁接成活率和嫁接愈合过程中砧穗生理特性可以得出，以枫杨和薄壳山核桃为砧木嫁接青钱柳的亲和性较差，表现为可溶性糖和淀粉易积累在接合部、POD活性低、单宁含量和PPO活性高等特点，观察也发现，以这两个树种为砧木嫁接的青钱柳苗木均出现后期不亲和的现象。综上可知，青钱柳本砧嫁接的亲和性显著高于异种嫁接，在嫁接愈合过程中，可溶性糖、淀粉、单宁含量、POD活性、PPO活性以及POD和PPO活性绝对差值可以作为其早期评价砧木与接穗嫁接亲和性的生理指标。