刘宏，易娅静，代巧妹，杨婧，仲丽丽，李冀

（黑龙江中医药大学 1.基础医学院病理学教研室；2.附属第一医院病理科；3.基础医学院方剂学教研室，哈尔滨 150040）

中医学“肾”的概念不同于西医学，它包括的概念更广。中医认为肾主生殖，能促进生殖器官的功能［1］。《灵枢·海论》说“ 脑为髓之海，肾主骨生髓通于脑”［2］。肾气充足，脑有所养，脑清神硕。肾气亏虚，则脑病易发［3-4］。左归丸是传统补肾名方，研究［5-7］显示，左归丸能发挥较好的神经元保护作用。近年的研究［8-9］表明性激素是维持脑功能及保护脑组织作用的重要因子。本课题组前期研究［10］发现左归丸能改善惊恐伤肾大鼠缺血后的脑损伤，并且上调神经营养因子的表达。但具体通路尚需进一步验证。本研究从“雌激素-雌激素受体”角度探讨左归丸对大鼠缺血后脑损伤的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

SPF 级8周龄SD雌性大鼠80只，体质量 （250±20） g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心 （许可证号：SYXK 黑2018005）。动物在标准条件下饲养［温度 （25±1） ℃，湿度45%～50%］。左归丸 （国药准字Z11020735） 购自北京同仁堂药店，17β-雌二醇、生物素化山羊抗兔IgG （型号A0277） 购自中国碧云天公司，ERα购自中国Proteintech公司，ERβ购自中国Sangon公司，DAB显色试剂盒、山羊血清购自中国Solarbio公司。MAP-2购自美国CST公司，Neun购自英国Abcam公司，DAPI购自中国Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 去势法构建肾虚模型［11］：大鼠腹腔正中切口，沿子宫角导出卵巢，行双侧卵巢摘除。结扎、缝合。

1.2.2 线栓法构建脑缺血再灌注模型：大鼠颈中部切开，于颈总动脉剪口，插入鱼线，插入长度0.75 cm左右，视大鼠个体差异而定，以向前无法推动为准。缺血1 h后拔出鱼线，行缺血后再灌注 （ischemiareperfusion，IR） 24 h。

1.2.3 动物分组及给药：80只SD大鼠随机分为5组，每组16只。5组分别为假手术组 （仅剪口，不插栓线，不行卵巢摘除）、IR组、去势+IR组、去势+IR+中药组、去势+IR+雌二醇组。卵巢摘除术后开始给药，17β-雌二醇 （100 μg/kg） 腹腔注射［12］，左归丸汤剂灌胃 （1.62 g/kg），1次/d。第10天行脑缺血手术，缺血1 h，再灌注24 h。

1.2.4 穿越横桥实验：采用FEENEY等研发的穿越横桥实验 （beam walking test，BWT） 检验大鼠运动功能。检测时间为大脑中动脉阻闭术后16、24、48、72 h和7 d。大鼠运动功能参考BWT评分法［13］分为7级 （0，完全不能穿过横桥；7，正常通过）。

1.2.5 ELISA法检测：行为学测试后 （第8天） 采用双抗体夹心法测定大鼠雌激素含量。

1.2.6 2，3，5-三苯基四唑氯化铵 （triphenyltetrazolium chloride，TTC） 染色：行为学测试后 （第9天） 将脑组织切除并-20 ℃冷冻30 min，然后切成2 mm薄片 （冠状切，每个脑组织切5片或6片）。1% TTC染色液37℃染色15 min。

1.2.7 HE染色：脑组织切片脱水、包埋，切片，用新鲜苏木素-伊红染色，常规脱水透明。

1.2.8 免疫荧光染色：石蜡包埋的大脑组织切成5 μm厚切片，60 ℃加热30 min。脱蜡脱水后，抗原修复10 min。随后山羊血清封闭30 min，在4 ℃隔夜兔单克隆抗体孵化：抗微管结合蛋白-2 （anti-microtubule binding protein-2，MAP2） （1 ∶200，上海北诺生物科技有限公司中国） 或抗神经元核抗原 （anti-neuronal nuclear antigen，NeuN） （1 ∶2 000）。PBS洗 涤，cy3标记的二抗IgG （1 ∶200，中国碧云天公司） 室温孵育1 h，4，6-二氨基-2-苯基吲哚 （4，6-diamino-2-phenylindole，DAPI；合肥Biosharp公司） 复染后在荧光显微镜下观察。

1.2.9 免疫组织化学：石蜡切片常规脱蜡至水，过氧化物酶室温封闭15 min，高火5 min，放入微波炉进行抗原修复，然后中火10 min，再高火5 min完成修复。一抗4 ℃过夜。滴加二抗，复染。

1.2.10 Western blotting检测雌激素受体α （estrogen receptor α，ERα）与雌激素受体β （estrogen receptor β，ERβ） 蛋白含量：常规蛋白提取，转膜，电泳，凝胶成像系统分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠运动功能检测结果

大脑中动脉阻闭术后16 h、24 h、48 h、72 h、7 d各时间点大鼠运动功能检测结果显示，与假手术组比较，IR组评分显著降低 （P＜ 0.01）。与IR组比较，去势+IR组评分明显下降 （P＜ 0.05）；与去势+IR组比较，去势+IR+中药组评分显著升高 （P＜ 0.05）。去势+IR+雌二醇组与去势+IR+中药组比较无统计学差异 （P＞ 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠梗死面积检测结果

假手术组大鼠脑组织未见梗死灶。与假手术组比较，IR组大鼠脑组织梗死灶面积明显增加 （P＜0.05），与IR组比较，去势+IR组大鼠脑梗死灶面积明显增加 （P＜ 0.05），与去势+IR组比较，去势+IR+中药组大鼠脑组织梗死灶面积明显减小 （P＜ 0.05），而去势+IR+中药组与去势+IR+雌激素组大鼠脑梗死灶面积比较无统计学差异 （P＞ 0.05）。见图1、表2。

表1 各组大鼠不同时间BWT评分比较Tab.1 Comparison of BWT score among different groups of rats at various timepoints

2.3 各组大鼠神经元比较

假手术组大鼠神经元排列正常，细胞核完整，IR组神经元中观察到核固缩、核碎裂、核消失。与IR组比较，去势+IR组神经元死亡更严重。与去势+IR组比较，去势+IR+中药组或去势+IR+雌二醇组神经元丢失减少。见图2。

2.4 各组大鼠雌激素水平比较

结果显示，与假手术组比较，IR组雌激素水平无统计学差异 （P＞ 0.05）。与IR组比较，去势+IR组大鼠雌激素水平显著降低 （P＜ 0.01）。与去势+IR组比较，去势+IR+中药组雌激素水平明显增高 （P＜0.01）。与去势+IR+中药组比较，去势+IR+雌二醇组雌激素水平显著升高 （P＞ 0.05）。见表2。

图1 TTC染色测定的各组脑梗死面积Fig.1 Cerebral infarction area measured using TTC staining

2.5 各组大鼠雌激素受体表达比较

结果显示，与假手术组比较，IR组ERα和ERβ水平显著升高。与IR组比较，去势+IR组大鼠ERα和ERβ水平降低 （P＜ 0.05）。与去势+IR组比较，去势+IR+中药组ERα和ERβ表达水平明显上调。而去势+IR+中药组与去势+IR+雌二醇组比较ERα和ERβ表达水平无统计学差异 （P＞ 0.05）。见图3～5、表2。

表2 各组大鼠脑梗死面积、雌激素水平、雌激素受体表达比较Tab.2 Comparison of cerebral infarct area，estrogen level，and ER expression in rats from each group

图2 各组神经元HE染色结果×200Fig.2 HE staining of neurons ×200

图3 各组大脑皮质ERα的表达 DAB 染色×400Fig.3 ERα expression detected in the cerebral cortex of each group using DAB staining ×400

3 讨论

临床研究［14］表明，补肾法可以改善轻度认知障碍，可以改善脑卒中患者的神经功能。实验研究［15］亦证实补肾中药可以改善阿尔兹海默病大鼠的痴呆症状。研究［16］报道左归丸含药血清可以诱导神经干细胞分化，减少神经细胞凋亡。本课题组前期研究［17］结果显示左归丸可以明显改善脑缺血大鼠的学习记忆能力并增加神经营养因子的表达。

图4 各组大鼠大脑皮质ERβ的表达 DAB 染色×400Fig.4 ERβ expression detected in the cerebral cortex of each group using DAB staining ×400

图5 各组大鼠海马ERα和ERβ表达比较Fig.5 Comparison of ERα and ERβ levels in rat hippocampi in each group

本研究结果显示，与假手术组比较，IR组大鼠穿越横桥困难，BWT评分显著降低，说明造模成功，大鼠有明显脑缺血症状。与IR组比较，大鼠摘除卵巢后BWT评分显著下降，说明卵巢摘除造成的雌激素缺失能够加重缺血再灌注损伤。应用左归丸后大鼠BWT评分增加，说明左归丸具有神经元保护作用，可以使脑缺血性损伤减小，与前期研究结果一致。TTC染色及HE染色结果显示大脑中动脉阻闭造成的缺血梗死灶出现在皮层下或者纹状体区，梗死中心区细胞变性坏死，梗死半暗带细胞丢失严重，排列紊乱，水肿现象明显，说明缺血对脑组织造成了形态和功能的损伤性改变，大鼠卵巢摘除后形态学损伤较单纯缺血明显加重，梗死面积增大。左归丸治疗后缺血脑明显改善，梗死面积减小，神经元丢失减少。神经保护作用左归丸与雌二醇相似。由此证实左归丸对缺血性脑损伤有确切的保护作用。

近年的研究［18］发现雌激素有明显的脑保护作用。中医传统理论认为“肾藏精”，主男女生殖之精［19］。已有研究［20］指出中医“肾主生殖”理论与现代医学“下丘脑-垂体-卵巢轴” 调节方向大致相同。大量研究［21-22］表明补肾中药具有促性激素样作用。LAI 等［23］研究发现左归丸对卵巢摘除小鼠发挥防治骨丢失的效果，因而具有雌激素样作用。本研究结果显示，假手术组大鼠脑皮质区ERα、ERβ仅有少量表达，说明正常情况下ERα、ERβ在脑内表达量较少；IR组大鼠脑皮质半暗带神经元ERα、ERβ的表达均明显高于假手术组，说明缺血刺激调动了机体的保护性机制，上调了ERα、ERβ的表达。可见ERα、ERβ均参与缺血后的脑保护。左归丸干预后大鼠 ERα、ERβ的表达均明显高于去势+IR组，说明左归丸可上调ERα、ERβ的表达，激活雌激素-雌激素受体通路发挥脑保护作用。

综上所述，左归丸通过“雌激素-雌激素受体”通路对大鼠缺血性脑损伤发挥保护作用，“雌激素-雌激素受体”可能是“肾脑相关”的关键通路之一。“肾通于脑”中医理论博大精深，可能关系到诸多现代生物分子机制，具体机制有待进一步验证和探索。