杜春蕾，高虎虎，马怀英，胡胜武，郭 媛

(西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100)

油菜是重要的经济作物之一，含有丰富的油脂和蛋白质，是食用油和工业油的重要来源[1]。芥菜型油菜(BrassicajunceaL.，2n=36，AABB)由二倍体亲本白菜(BrassicarapaL.，2n=20，AA)与黑芥(BrassicanigraL.，2n=16，BB)自然杂交后异源多倍化进化而来[2]。芥菜型油菜生育期长、成熟期晚，主根发达且入土深，具有天然黄籽、抗旱、耐瘠等优点，且芥菜型油菜所榨菜油香味浓郁，深受消费者喜爱[3]。由于极端灾害天气频发，抗逆性的好坏对油菜品种来说格外重要[3]，芥菜型油菜抗逆性较强，是非常具有应用潜力的种质资源。与其他大田作物相比，油菜杂种优势显著，利用杂种优势是提高油菜产量的重要途径[4]。中国油菜杂种优势利用的研究起步较早，杂交油菜的选育和应用都处于世界先进水平。油菜杂种优势利用途径主要包括细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)、细胞核雄性不育(Genic male sterile，GMS)、生态型不育(Ecological male sterility，EMS)、自交不亲和(Self incompatibility，SI)、化学杂交剂(Chemical hybridization agent，CHA)诱导的雄性不育[4]。其中，化学杂交剂诱导的雄性不育又称化学杀雄，相对于其他杂种优势利用途径，化学杀雄具有两系育种、组合自由、可多代利用及育种周期短的优点[5]。

自20世纪50年代初报道了马来酰肼(植物生长调节剂，Maleic Hydrazide)可诱导玉米产生雄性不育后[6]，化学杂交剂的研究飞速发展，接连发现NAA(萘乙酸，Naphthaleneacetic acid)，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)等植物生长调节剂可诱导不同作物雄性不育[7-8]。但这些植物生长调节剂大多诱导效率低，对植株的生长和雌蕊的发育有负面效应，无法应用于生产实践[9]。1970年后，相继筛选出杀雄剂1号[10]、杀雄剂2号[11]、TO3[12]、杀雄剂3号[13]等用于水稻的化学杂交剂，黄雪清等[13]对不同水稻品种施用杀雄剂3号，90%的供试品种杀雄效果在97.2%以上。小麦中也筛选出RH531[14]、WL84811[15]、SQ-1[16]、GENESIS[17]等杀雄效果不错的化学杂交剂，高庆荣等[17]使用GENESIS诱导小麦，杀雄效果达到95%，且具有一定的广谱性。Song等[16]发现SQ-1对不同小麦品种的杀雄效果均到达95%以上。目前，油菜上公开报道的化学杀雄剂主要有甲基坤酸盐类(杀雄剂1号[18]，杀雄剂2号[19])、KMS-1[20]，磺酰脲类(苯磺隆[21]、酰嘧磺隆[22]、氯磺隆[23]、EXP[24]、EN[25]、SX-1[26]、ESP[27]等)，咪唑啉酮类[23](咪草烟、甲氧咪草烟)，以及磺酰胺类[23](氟唑磺隆)等。芥菜型油菜杂种优势的主要利用途径是细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)[28]。印度学者报道了较多适用于印度的CMS[29]，国内应用的不育胞质类型主要是hau CMS[30]，由于可利用的芥菜型油菜不育种质单一，芥菜型油菜的杂种优势利用受到了限制。化学杂交剂制种可以克服不育系对基因型的依赖性，是解决芥菜型油菜不育种质单一的有效途径。Singh等[31]研究表明2% Surf Excel可诱导芥菜型油菜100%不育，且对产量影响较小，但由于缺乏后续研究，未能广泛应用。Yu等[22]发现酰嘧磺隆可诱导芥菜型油菜雄性不育，但育性不稳定。井苗[32]以0.3μg/mL浓度的苯磺隆溶液处理芥菜型油菜可诱发100%全不育，但育性在后期不稳定。在众多类型的化学杂交剂中，由磺酰脲类除草剂研发得到的化学杀雄剂效果好、制种产量高且成本低廉。磺酰脲类化合物作用于植物乙酰乳酸合成酶(ALS)，通过抑制支链氨基酸的合成来抑制细胞分裂。动物体内不存在该化合物的靶标酶，因此磺酰脲类除草剂低毒、高效。单嘧磺酯钠(Monosulfuron Ester Sodium，MES)是由李正名院士课题组研发的磺酰脲类除草剂，该药是中国创制的具有自主知识产权的除草剂新品种[33]。Cheng等[34-35]研究发现0.05～0.10μg/mL MES可较好地诱导甘蓝型油菜雄性不育，其机理研究表明用MES处理甘蓝型油菜后得到的差异表达蛋白能够引起代谢紊乱，从而引起绒毡层发育异常和小孢子不育。Li等[36]利用0.1μg/mL的MES诱导甘蓝型油菜雄性不育后进行转录组分析，发现大部分差异表达基因定位于质体和线粒体中，且主要富集于糖类、脂质代谢、细胞运输等通路。

本试验以3份不同芥菜型油菜自交系为材料，对MES的杀雄效果及其农艺性状的影响进行研究，旨在找到MES杀雄有效质量浓度，并通过细胞学观察来初步揭示MES化学杀雄的机理。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的芥菜型油菜自交系材料共3份，分别为关中芥、L2598、芥菜野生型，以上材料均为西北农林科技大学胡胜武老师课题组收集。试验于2016-2017年在西北农林科技大学农作物标本区(34°16′N，108°E)进行。利用随机区组进行设计，分别设置3个重复，每小区包括4行，每行大约20棵植株，行长为2 m，行距为0.50 m，株距为0.10 m。土壤肥力中等，按照油菜大田常规管理，并于2017年5月收获。

1.2 喷药处理

供试除草剂原药单嘧磺酯钠(Monosulfuron Ester Sodium，MES，C14H13N4O5SNa)，由南开大学李正名院士惠赠。称取0.01 g MES，加入200 mL蒸馏水，配成200 mL 50 mg/L的MES母液存于4 ℃。取50 mg/L的母液0.75 mL、1 mL分别配置500 mL的0.075 mg/L、0.1 mg/L的药液。第1次喷药在油菜现蕾期最大花蕾长度为1～2 mm时，用小型手动喷雾器将MES均匀喷施于叶面，单株平均用药量为8～10 mL。第2次喷药在第1次喷药后7～10 d进行。同时设置清水对照。

1.3 农艺性状的调查与统计分析

盛花期对各株系各浓度材料育性进行考察，喷药处理后在盛花期每3 d调查1次育性变化。统计全不育、半不育和可育等各类植株数量。测定自交和异交结实率，评估雌蕊与雄蕊育性。记录整个花期所持续的时间，分别包括初花期、盛花期和终花期。此外，分别在每个小区随机采取10朵花，对其花器官特征，包括花冠大小、花瓣长和宽、雌蕊、花药和花丝长度等进行测量；在成熟期分别在各小区内随机抽取10棵植株进行考种，考察性状分别包括：株高、分枝部位、一级分枝数、二级分枝数、主序长度、主序角果数、全株角果数、每角粒数、角果长度等产量相关性状。

用Win-Excel软件对芥菜型油菜育性、花器官、农艺性状等数据进行处理，利用SPSS(version 23.0,IBM SPSS Statistics,Chinese)软件对数据进行方差分析，使用Duncan’s多重比较法分析不同处理间的显著性差异。

1.4 花粉活力和花药败育的细胞学观察

在油菜初花期随机采取对照和不同质量浓度(0.075 μg/mL、0.1 μg/mL)MES处理的植株主花序(L2598)并立即用卡诺氏液(乙醇∶冰醋 酸=6∶1)固定2 h，然后用分级乙醇系列(100%、95%、85%、75%和70%)脱水，每次约 1～2 h，在4 ℃下储存，直至使用。用镊子轻轻挤压花药，将花粉粒释放到醋酸洋红溶液中，利用OLYMPUS BX51(Olympus，Japan)显微镜观察花粉活力以及花药败育时期[37]。

取对照和0.1 μg/mL MES处理的植株(L2598)主花序，将其花药切成小块，并立即浸入4 ℃的磷酸盐缓冲液(PBS，0.1 mol/L，pH 6.8)中，将其浸入由4%戊二醛组成的溶液中直至使用。分别用PBS(0.1 mol/L，pH 6.8)冲洗5、10、15、20和30 min后，将标本置于1%四氧化锇 (0.2 mol/L PBS，pH 6.8)中于4 ℃固定2 h。然后用上述PBS缓冲液再次洗涤样品。然后，使用30%、50%、70%、80%、90%和100%梯度乙醇系列分别将花药脱水15 min，然后在树脂(伦敦树脂公司，雷丁，英国)∶酒精为1∶1混合物中渗入过夜，之后再在纯树脂中两次(分别为7 h和3 h)将样品放入明胶胶囊中，装满树脂并在60 ℃孵育48 h以进行聚合。使用Leica EM UC7超薄切片机(Leica，Nussloch，Germany)将半薄切片切成 1 μm厚的切片，用1%甲苯胺蓝溶液染色，最后在OLYMPUS BX51显微镜明场视野下观察拍照[38]。

2 结果与分析

2.1 MES诱导芥菜型油菜雄性不育效果

在杀雄试验中，不同浓度的MES均能引起3个芥菜型油菜材料不同程度的不育。虽然3个株系在抗药性上存在差异，但引起3个材料不育的浓度并不存在差异。表1结果表明，低质量浓度处理下L2598和芥菜野生型出现了可育花粉，自交结实率分别为7.26%和1.51%。高质量浓度处理下3个品种的结实率均为0，关中芥和芥菜野生型的不育株率达到100%，但是有较为严重的药害并伴有死蕾现象，以关中芥最为严重，L2598的不育株率达到96.30%。

表1 MES对芥菜型油菜杀雄效果

2.2 MES诱导芥菜型油菜雄性不育对其农艺性状的影响

化学杂交剂的筛选在于确立能够诱导完全不育的最低浓度，从而将药害降到最低。评估一个优良的化学杂交剂的标准主要包括两方面，其一，能诱导完全不育；其二，对主要农艺性状没有影响或影响较小。

本试验对MES各质量浓度处理后的L2598植株的农艺性状进行了统计。如表2所示，低质量浓度(0.075 mg/L) MES处理后，L2598各农艺性状与对照相比无显著差异。高质量浓度(0.1 mg/L)处理下MES对L2598的全株角果数和角果长度有显著影响，对每角粒数有极显著的抑制作用，但是喷药处理对株高、分支部位、分枝数、主花序长度和角果数没有显著影响。

表2 MES处理下芥菜型油菜主要农艺性状的比较

2.3 MES诱导芥菜型油菜雄性不育对其植株生长发育的影响

优良的化学杂交剂应在保证不育的同时，应将对植物生长发育的影响降到最低。MES在引起不育的同时，对植物的生长发育也有影响。本研究发现，在有效杀雄浓度下L2598生长发育受到抑制。研究发现抽薹时，经MES处理的植株其节间的伸长受到抑制，且处理后，花期推迟，高浓度处理比低浓度处理花期推迟更多。

此外，喷药处理还对花器官的形态产生较大影响。首先是喷药处理后的主花序和雌蕊略微变短(图1-A和1-B)。与可育材料雄蕊相比，不育花药在早期发白，至后来逐渐干枯出现干瘪、瘦小、有些成三角形。高浓度处理下雄蕊缩短，花丝不能伸长，花药干瘪，无可育花粉，花药败育很彻底(图1-C)。其次喷药处理还引起了雄蕊发白，萼片、花柄、花轴和花瓣褪色，以高浓度更为显著(图1-D)。喷药处理还引起了(1)花蕾和茎秆发紫；(2)角果变短；(3)叶片不均匀泛黄，叶脉失绿，部分叶片卷曲，略有畸形(图1-E)。

将MES对花发育的影响进行统计(表3)，发现各项与花发育相关的指标均有显著差异，经MES处理的油菜花器官的各个组成部分均显著变小，以高质量浓度的更为显著。

表3 MES处理下对芥菜型油菜花器结构特征的分析

2.4 MES诱导芥菜型油菜雄性不育的细胞学 观察

2.4.1 压片观察 取L2598的花粉亚历山大染色后进行压片观察，可育小孢子细胞核可被染成紫红色，不育小孢子不能着色(图2)。在0.075 mg/L和0.1 mg/L两种MES质量浓度下都未见可育孢子，且不育孢子在体积上均小于对照(图2-A，图2-B，图2-C)。在油镜下进一步观察发现不育小孢子表现出较为严重的细胞壁畸形，其中0.1 mg/L处理下尤为严重(图2-D)，畸形小孢子的数量相对更多。

为进一步探究MES诱导芥菜型油菜花粉不育的过程，对喷施清水的对照和0.1 mg/L MES处理植株花粉粒(L2598)用醋酸洋红染色后进行压片观察(图3)。醋酸洋红染色后，可育小孢子为鲜红色，不育小孢子呈铁锈色或不能着色。压片结果显示在花粉母细胞时期(图3-A和图3-B)，喷药处理后的花粉粒已经出现异常。虽然MES处理过的花粉颗粒在细胞形态上完整，与对照无明显差异，但细胞着色整体较浅。至四分体时(图3-C和图3-D)，MES诱导的花粉颗粒出现部分四分体不能着色，且所有小孢子着色浅。四分体之后不育小孢子呈铁锈色，可育小孢子为鲜红色(图3-E～J)。总的来说，MES处理后，小孢子早期细胞基本完整，晚期出现空的小孢子，且所有小孢子都出现一定的畸形。

2.4.2 半薄切片观察 为探究MES引起芥菜型油菜败育的机理，对喷施清水对照和0.1 mg/L MES处理的L2598全不育株花药进行半薄切片试验，用苯胺蓝染色后置于光学显微镜下观察。

半薄切片的结果显示，在造孢细胞时期(图4-A和图4-B)，喷药处理与对照差异并不明显，整体着色都较浅，处理的绒毡层并无异常。至花粉母细胞时期(图4-C和图4-D)，MES处理后与对照相比着色显著加深，此外在形态上二者差异不明显，但在绒毡层细胞形态上存在差异。对照绒毡层紧贴内壁，形状规则，而经MES处理的绒毡层轮廓不清晰。发育至四分体时期(图4-E和图4-F)，MES处理出现很大差异。对照四分体着色很深且外围胼胝质着色较浅，而MES处理过的四分体着色很浅，胼胝质相对深一些。MES处理的绒毡层几乎不能被染色，细胞呈畸形状态。至单核早期(图4-G和图4-H)，对照和MES处理小孢子都已经释放，绒毡层也已经开始降解，但MES处理的小孢子明显染色较浅，且绒毡层几乎没有内容物。单核晚期(图4-I和图4-J)，对照小孢子发育正常，染色较深，而MES处理的绒毡层完全降解、小孢子没有内容物。

综上所述，认为喷施单嘧磺酯钠引起芥菜型油菜花粉败育发生在四分体至单核晚期。观察到喷施MES后，在四分体时期处理的绒毡层发育异常，这可能是引起小孢子败育的主要原因。

3 讨 论

化学杂交剂制种可以克服不育系对基因型的依赖性，是解决目前国内油菜应用不育胞质类型单一的重要途径之一。在油菜杂交种实际生产中，开发更多高效、低毒、稳定，同时具有中国自主知识产权的化学杂交剂是目前化学杀雄育种技术的重要任务[30]。

中国早期开发的杀雄效果较好的赤霉素，杀雄效果达到70%～100%，但杀雄效果稳定性差；甲基砷酸锌的杀雄效果为80%～100%[18-19]，但该类CHAs含有毒砷元素。由磺酰脲类除草剂研发得到的化学杀雄剂EN[25]、ESP[27]、EXP[24]、SX-1[26]、苯磺隆[21]等在甘蓝型油菜中的杀雄效果较好，不育率达到90%以上，而且具有成本低廉、低毒的优点，但大都包含受国外知识产权保护的成分。

目前，芥菜型油菜中磺酰脲类化学杀雄剂的相关研究较少，Yu等[22]发现酰嘧磺隆可以诱导芥菜型油菜雄性不育，但育性不稳定；井苗[32]发现0.3 μg/mL的BHL溶液可诱导芥菜型油菜100%全不育，但后期育性不稳定。本研究以3份芥菜型油菜自交系为材料，对现蕾期叶面喷施MES诱导芥菜型油菜雄性不育的作用效果进行了研究。试验结果表明，单株受药量在8～10 mL时，0.075 mg/L和0.1 mg/L两个MES质量浓度梯度处理下均能有效诱导芥菜型油菜不同程度的不育。0.075 mg/L的MES可以诱导关中芥完全不育，0.1 mg/L MES处理后3个品种的不育株率可以达到96.30%～100%。与前期开发的多种化学杂交剂相比，MES的杀雄效率高、杀雄效果稳定，并且低毒、环保，拥有自主知识产权。

邢泽农[39]对MES诱导甘蓝型油菜雄性不育进行了研究，结果发现0.1 μg/mL MES处理对株高、单株果粒数、角果粒数没有显著影响，0.2 μg/mL MES处理后植株株高显著降低，单株角果数和全株粒数上升，角粒数变化不大。Yu等[40]发现叶面喷施0.10 μg/mL MES对甘蓝型油菜的株高、角粒数有一定的负面影响，对单株角果数，全株粒数有一定的增加作用，但对单株产量没有明显影响，并且不同基因型油菜之间的反应存在差异。本研究中，MES处理对农艺性状的影响因品种而异，0.1 mg/L质量浓度下，关中芥植株药害大并伴有死蕾现象，而L2598的植株药害轻，全株角果数呈上升趋势，每角粒数降低，角果长度变短。Cheng等[34]研究发现喷施MES对甘蓝型油菜植株的花瓣和雌蕊没有受到明显影响。本研究中，两种浓度MES处理后的油菜植株花期均推迟，植株的花序和雌蕊略微变短；雄蕊花丝明显变短，花药变短、干瘪；叶片随MES处理浓度增加而变小。此外，发现MES处理后的植株花冠直径、花瓣长度和宽度均显著变小，高浓度处理下减小幅度更为显著。这与Yu等[40]用苯磺隆处理后的甘蓝型油菜所表现出的开花时间延迟，开花时间缩短，以及植物高度和花器官尺寸减少是一致的。

化学杂交剂诱导植株雄性不育研究中绒毡层液泡化、异常膨大、提前或是延迟解体等现象较为常见，且异常的小孢子细胞在花粉发育的各个时期不断产生和积累，导致成熟期花粉全部败育[24,32,41]。本研究选取0.01 μg/mL MES处理的L2598进行细胞学观察，结果发现小孢子在花粉母细胞时期就已经出现异常，早期细胞基本完整，晚期逐步出现空的小孢子，且所有不育小孢子皆出现较为严重的细胞壁畸形；MES处理植株的的绒毡层在造孢细胞时期与对照差异不明显，花粉母细胞时期二者开始存在轻微差异，绒毡层轮廓模糊，发育至四分体时期绒毡层细胞呈不规则膨大，单核早期时绒毡层几乎没有内容物且延迟降解。笔者认为喷施MES导致花粉败育发生在四分体至单核晚期之间，在这段时期内不断有败育花粉产生，直至成熟期全部花粉败育。化学杂交剂诱导的雄性不育是从多方面、多途径来诱导败育花粉不断产生，最终导致雄性不育，本研究中植株绒毡层发育异常且延迟降解，可能是引起小孢子败育的主要原因。

本研究旨在不影响芥菜型油菜农艺性状的前提下找到较好杀雄效果的MES浓度。研究发现叶面喷施0.075 mg/L的MES可诱导关中芥完全不育，且对主要农艺性状影响较少。0.1 mg/L的MES杀雄效果最好，但对农艺性状的影响较显著，关中芥死蕾现象严重，不宜在杂种优势利用中推广。任何一种化学杀雄剂都有适宜的使用浓度及其使用方法，油菜中磺酰脲类杀雄剂的有效杀雄浓度为0.02～20 μg/mL[21,24-27,31-32]。Cheng等[35]用MES在49个甘蓝型油菜上试验表明，单核期用0.05～0.10 μg/mL MES处理产生的不育株率为99.3%～100%。张宝娟等[42]对甘蓝型油菜喷施0.075～0.1 μg/mL的苯磺隆得到94%～100%的不育株率。Yu等[21]发现苯磺隆、EXP[24]诱导甘蓝型油菜雄性不育的最适质量浓度分别为0.2 μg/mL和0.25 μg/mL。刘绚霞等[25]认为甘蓝型油菜用0.5～0.8 μg/mL EN处理杀雄效果最好，全不育株率在95%以上，不育株率为100%。严自斌等[27]研究表明0.3～ 0.6 μg/mL的ESP诱导甘蓝型油菜雄性不育的效果最佳，不育株率达98%。本研究中MES诱导芥菜型油菜雄性不育的最适质量浓度为 0.075～0.1 μg/mL，较MES或其他磺酰脲类化学杂交剂诱导甘蓝型油菜雄性不育的最佳杀雄浓度范围更小，且细微浓度差异即可造成杀雄效果和农艺性状的显著差异，说明芥菜型油菜可能对MES更加敏感，而且不同品种自交系的芥菜型油菜对MES的敏感性存在差异。本研究探讨了MES诱导芥菜型油菜雄性不育的作用效果，并对其不育花药败育的特征进行了观察，从而为确定MES诱导芥菜型油菜雄性不育的最佳杀雄浓度提供了有价值的参考。