杜 璨，耿增超

(1.杨凌职业技术学院，陕西 杨陵 712100；2.西北农林科技大学 资源环境学院/农业部 西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西 杨陵 712100)

云杉林(Piceaasperata)和红桦林(Betulaalbosinensis)是秦岭2种典型森林类型，分布面积大，主要分布秦岭的中部，绝大部分属于天然次生林[1-2]。云杉和红桦具有对养分要求低、环境适应能力强、防病虫害能力强和经济价值高等特点，在秦岭森林生态系统的恢复与保护方面起着重要的作用[1-2]。

土壤微生物对森林土壤生态系统来说至关重要，其参与土壤养分循环和能量转换[3-4]，具有改善土壤质量，促进土壤稳固，维持土壤生态系统的稳定性的作用。土壤细菌作为微生物中最主要的群体，其数量大、分布广，是地球生物化学循环的重要驱动者。有研究表明，土壤细菌群落的组成和多样性与土壤有机碳的转化有关[5]，参与土壤有机质分解等过程[6]。因此，研究森林生态系统土壤细菌群落对于深入探讨森林生态系统结构与功能以及物质循环具有非常重要的作用。

土壤细菌对土壤环境变化具有高度的敏感性，随着季节的更替养分含量随之改变，势必会影响土壤细菌群落组成以及多样性[7-8]。林分生长旺盛期和凋落高峰期会促使土壤养分改变，从而引起了土壤细菌群落组成的变化[9]。此外，季节性的温、湿度变化也是影响细菌群落分布的重要因素[9]。C.A.Sierraetal[10]研究发现，在众多因素当中，土壤细菌群落组成及多样性变化主要受土壤温度的影响。也有研究发现，随着温度的降低，古生菌的数量会相对增加[11]。杨杰等[12]对南方红壤中细菌的研究发现，细菌多样性和结构受到土壤含水量的影响。但是，关于秦岭云杉和红桦林的研究主要集中在土壤酶活性、土壤养分等方面[13-14]，对云杉林和红桦林土壤细菌群落组成季节性变化的研究鲜有报道。本研究选取辛家山云杉林和红桦林土壤为对象，在4个季节采集表层土壤样品，研究土壤细菌的多样性及群落组成与土壤环境因子的关系，揭示土壤细菌的季节性分布和土壤细菌组成对不同季节土壤性质的响应，以期为更好地了解细菌群落在森林土壤生态系统中的作用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区辛家山隶属陕西省宝鸡市凤县，位于秦岭山脉的西部南坡[13-14]，行政区域隶属陕西省宝鸡市凤县。秦岭山脉是我国南北方地区分水岭，由于地处秦岭主梁南侧的嘉陵江上游地区，辛家山地区属暖温带半湿润山地气候，海拔最高处2 739 m，地势最低处1 580 m，整体呈地势西高东低，森林覆盖率高，达96.8%，年均温7.6℃，年平均降水量900 mm，7-9月的降雨尤为集中，年平均气温7.6℃[13-14]。在该区域内，选取2种天然次生林：云杉和红桦，样地详情见表1。

1.2 土壤样品的采集与处理

2015年7月、2015年10月、2016年1月和2016年4月在云杉林和红桦林中分别选取3个采样样方(20 m×20 m)。每个样方中选取5个采样点，每个采样点中用五点法采集0～10 cm的土壤样品。采集的鲜土样除去石子和根系残体等后，将同一样方内各采样点的土样混合均匀，装入无菌自封袋中，冷藏运回实验室。取其中一部分土壤样品在-80℃条件下冷藏，以便提取细菌DNA，一部分贮藏于4℃的冰箱内，用来测定DOC和MBC，剩一部分室内风干过筛，测定其他理化指标。

1.3 土壤理化性质分析

土壤样品采集当天，使用地温计测定每个采样点土壤5 cm处的温度(ST)3个重复。土壤含水量采用烘干法(105±2)℃。土壤pH采用电位法(水∶土=2.5∶1)[15]。土壤有机碳(SOC)采用重铬酸钾氧化-外加热法测定[16]。可溶性有机碳(DOC)采用去离子水震荡浸提[17]。土壤易氧化有机碳(EOC)采用K2MnO4氧化法[18]。土壤微生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法[19]。

1.4 土壤细菌DNA提取、测序和处理

使用美国OMEGA公司Fast DNA SPIN Kit(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)试剂盒并按照说明提取基因组DNA。利用1%琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检。选择16S rDNA的V3-V4区进行扩增，正向引物为341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，反向引物是806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。使用KAPA Hi Fi Hotstart Ready Mix PCR kit高保真酶进行PCR扩增，扩增的产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。使用Illumina MiSeq PE300进行上机测序。

对原始数据进行质控之后，用软件QIIME进行过滤、拼接、去除嵌合体，通过97%相似度的标准聚类，得到聚类成操作分类单元(OTUs)，每个OTUs被认为可代表1个物种[[20]，在16S数据库中进行比对[21]。根据OTUs列表中的各样品物种丰富度情况，应用软件mothur(http://www.mothur.org/)中的summary.single命令[22]，计算丰富度Chao1指数和Shannon指数，公式如下：

表1 样地基本概况Table 1 Basic status of sampling plot

(1)

式中，Schao1为估计的丰富度；Sobs为观测得到的总物种数；n1为只含有1条序列的OTUs数目；n2为只含有2条序列的OTUs数目。

(2)

式中，Hshannon为估计的多样性；Sobs为观测得到的OTUs；ni为第i个OTUs中个体的数目；N为群落中物种总数。

1.5 数据分析

利用Pearson相关系数法和Canoco 5.0软件的冗余分析(RDA)进行土壤性质和细菌群落的分析。采用统计分析软件(SPSS 20.0)的单因素方差分析功能分析季节对土壤性质、土壤细菌多样性的影响。

2 结果与分析

2.1 季节对土壤性质的影响

由表2可知，2种林分土壤均呈酸性，相同季节红桦林土壤pH大于云杉林。与云杉林相比，红桦林具有较高的SOC、EOC、DOC、MBC。季节对ST、SWC、SOC、EOC、DOC、DOC有显著影响(P<0.05)。夏季最高温在13℃左右，冬季最低温在-1℃左右。土壤有机质和易氧化有机碳含量在秋季最大，冬季最低，春季、秋季居中，可溶性有机碳微生物生物量碳含量表现为：夏季>秋季>冬季>春季，微生物生物量碳含量呈现出夏季>秋季>春季>冬季的特征。

表2 云杉林和红桦林的土壤基本理化性质Table 2 Soil basic properties in P.asperata and B.albosinensis forests

2.2 季节对土壤细菌群落多样性指数的影响

由表3可知，春季和秋季云杉林Chao1指数和Shannon指数高于红桦林夏季具有较高的Chao1指数和Shannon指数最高，除红桦林Shannon指数外，Chao1指数和Shannon指数均在冬季最低。在云杉林中，夏季土壤Chao1指数分别是秋季、冬季和春季的1.71、2.98和1.48倍；Shannon指数分别是秋季、冬季和春季的1.07、1.16和1.11倍。在红桦林中，夏季土壤Chao1指数分别是秋季、冬季和春季的1.27、2.43和51.66倍；夏季Shannon指数分别是秋季、冬季和春季的1.14、1.06和1.16倍。

2.3 季节对2种林分土壤细菌群落组成的影响

高通量测序检测到云杉林和红桦林表层土(0～10 cm)中的细菌有32门，62纲，70目，155科，344属；其中门(phylum)和属(genus)水平的细菌群落组成见图1、图2。2种林分土壤中检测到的主要细菌门有：酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和Latescibacteria等。酸杆菌门、变形菌门和拟杆菌门是2种林分土壤中占主导地位的细菌门，所占比例总和达到70%以上。在云杉林中，酸杆菌门的相对丰度在秋季达到最大值70.51%，较春、夏和冬季分别增加17.47%、24.86%和133.99%。而变拟杆菌门与酸杆菌门相反，在冬季达到最大值27.22%，分别是春、夏和冬季的3.77、7.81和13.27倍，变形菌门的相对丰度在夏季高于其他季节。在红桦林中，酸杆菌门的相对丰度在秋季达到最大值60.71%，较其他3个季节增加16.46%～280.73%。变形菌门在夏季达到最大值，分别是春，秋和冬季1.14、1.58、1.83倍，而拟杆菌门的相对丰度在冬季最大，较春，夏和秋季分别提高了770.04%、509.26%、1496.18%。放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和Latescibacteria在4个季节的变化范围为4.40%～9.24%，0.18%～15.39%，1.02%～5.14%，1.60%～7.03%。

图1 云杉林和红桦林土壤细菌门相对丰度Fig.1 Relative abundances of bacterial communities at phylum level in the soils of P.asperata and B.albosinensis forests

图2 云杉林和红桦林土壤细菌属相对丰度Fig.2 Relative abundance of bacterial communities at genus level in the soils of P.asperata forest and B.albosinensis forests

在云杉林和红桦林土壤中，主要的优势菌属为Gp4、Gp6、Gp16、拟杆菌属(Bacteroides)、Latescibacteria_genera_incertae_sedis和Gp2。季节对优势菌属有显著的影响，2种林分冬季土壤中的Gp4、Gp6、Gp16和Latescibacteria_genera_incertae_sedis相对丰度要低于其他季节。而拟杆菌属的相对丰度在冬季达到最大值，可达27%左右，夏季和秋季相对丰度接近为零。

2.4 土壤细菌α多样性与土壤性质的相关性分析

土壤细菌多样性与土壤酶活性相关性分析见表4。在云杉林中，Chao1指数与SWC、SOC、DOC和MBC呈极显著正相关(P<0.01)，与ST呈极显著负相关(P<0.01)。Shannon指数与SWC、SOC、DOC和MBC呈极显著正相关(P<0.01)，与ST呈极显著负相关(P<0.01)，与pH呈显著正相关(P<0.05)。在红桦林中，Chao1指数与pH、SWC、SOC、DOC和MBC呈极显著正相关(P<0.01)，与ST呈极显著负相关(P<0.01)，与EOC呈显著正相关(P<0.05)。Shannon指数与pH、SOC和DOC呈极显著正相关(P<0.01)，与ST呈极显著负相关(P<0.01)，与MBC呈显著正相关(P<0.05)。

2.5 土壤细菌群落与土壤性质的RDA分析

为探明影响细菌群落的主导因子，在门水平上对细菌群落进行冗余分析(RDA)(图3)。RDA的两轴的累积贡献率分别为43.6%和12.66%。土壤pH、SWC、ST 、SOC 、EOC、DOC和MBC共同解释了69.2%的细菌群落组成变化。由表5可知，SWC是影响真菌群落组成的主要因素，解释率为42%(F=15.9,P=0.001)，其次是EOC(F=4.4,P=0.005)和SOC(F=3.2,P=0.005)，解释率分别为10.1%和6.6%(表5)。土壤因素的影响顺序为：SWC>EOC>SOC>DOC>ST>MBC>pH。

3 结论与讨论

3.1 结论

秦岭云杉林和红桦林表层(0～10 cm)土壤中，季节对土壤细菌Chao1指数和Shannon指数有显著影响，与秋、冬、春季相比，夏季Chao1指数和Shannon指数较高。

2种林分的酸杆菌门和拟杆菌门呈现出明显的季节性变化特征。夏季酸杆菌门相对丰度高于冬季，而拟杆菌门相对丰度则表现出冬季高于夏季的特征。

土壤养分含量、土壤温度和湿度的季节性变化对细菌多样性和群落组成有显著影响。

3.2 讨论

3.2.1 2种林分土壤性质的季节变化特征 在森林生态系统中，秦岭地区季节性的温度变化会驱动土壤温度的改变，因此土壤温度呈现出夏季高、冬季低的特征。土壤含水量与降雨、降雪有关，虽然秦岭降雨主要集中在7-9月，但是由于蒸发较快，因此夏、秋季节土壤含水低于冬、春季节，春季积雪消融增加了土壤中的水分含量。

注：Aci.acidobacteria；Bac.bacteroidetes；Pro.proteobacteria；Fir.firmicutes；Act.actinobacteria；Lat.latescibacteria；Chl.chloroflexi；Eur.euryarchaeota。图3 土壤细菌群落和土壤环境因子的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of soil bacterial phyla and soil properties

不同树种可通过影响林地微环境、凋落物量与分解速率，以及根系的周转等过程，进而对土壤pH、碳等产生影响[23-24]。林分类型对土壤性质有显著影响，红桦林中SOC、EOC、DOC和MBC高于云杉林，主要是因为落叶阔叶林外源碳输入量较高，且易分解，促进了土壤养分的积累。本研究中，秋季土壤EOC含量高于其他季节，冬季最低。主要与植被的生长季和凋落期有关[25]，秋季是凋落物增加的时期，促进了土壤有机碳的输入，使土壤EOC含量升高[26]，在夏季植被生长进入旺盛期，需要从土壤中获取更多养分，因此加速了土壤SOC的矿化[27]，使EOC含量有所降低。DOC含量表现出夏季高、春季低的特征，主要是因为DOC含量会受到降水影响而淋失的影响[28]。秦岭地区，降雨主要集中在7、8、9月，4月温度回升积雪开始融化引发较强的淋失作用，因此这2个时期DOC含量降低。本研究中MBC含量在夏季最大，冬季最低，这一结果与P.K.Jiangetal[29]对雷竹林土壤微生物的研究相反，这与季节性的土壤温、湿度变化相关，因为7-9月适宜的温、湿度条件有利于微生物的生长繁殖，而冬季气温低不利于微生物生长[30]。

3.2.2 2种林分土壤细菌多样性的季节变化特征 在同一气候条件下，植被类型是影响土壤微生物群落的重要因素。不同植被具有不同的凋落物、根系分泌物，从而会对土壤细菌群落产生影响[31]。崔芳芳等[32]的研究表明,与针叶林相比阔叶林地具有较高的土壤微生物的数量。本研究中春季夏季红桦林多样性指数较高，因为春夏季红桦林养分含量高，有利于细菌生长繁殖，而秋冬季节，红桦林凋落物大量积累，覆盖于土壤表面使得空气不流通，不利于细菌生长；相反，云杉林为常绿针叶林，凋落物量较少。在同一植被不同季节条件下，土壤细菌群落多样性在夏、秋季显著高于冬、春季，表明土壤微生物在夏、秋季节最活跃的，导致这种现象的原因有2个：一方面，夏季植物进入光合旺季，光合产物通过根系进入土壤促进了微生物的生长繁殖[9]，秋季凋落物达到鼎盛，为微生物的生长提供了充足的碳源，这也表明土壤有机质等营养元素在细菌群落形成过程中发挥着重要的作用[33]。另一方面，季节性的土壤温、湿度变化也会影响土壤细菌多样性。有研究表明，随着温度的升高，微生物活性和物种丰富性也会升高[10]。温度降低，特别是低于0℃以下，细菌内液会发生冰冻现象、造成细胞破裂死亡[34]，降低了细菌数量。因此，本研究结果证明环境因子也是驱动群落多样性季节性差异的重要因素。

3.2.3 2种林分土壤细菌群落组成的季节变化特征 2种林分土壤中酸杆菌门、变形菌门和拟杆菌门均是土壤中占主导地位的细菌门，这一结果与杨立宾等[35]的研究结果一致，在汤旺河国家公园森林土壤中，Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes为优势菌门。C.L.Lauberetal[36]的研究发现,在酸性土壤中酸杆菌门和变形菌门等是主要细菌类群。季节对细菌群落丰度的影响明显高于群落组成。夏季具有较高的酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度，冬季具有较高的拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度。本研究经RDA分析可以看出，拟杆菌门与土壤SOC、EOC、DOC和MBC等呈负相关，酸杆菌门与土壤SOC、EOC、DOC和MBC等呈正相关，这与前人的研究结果不同。已有的研究证明酸杆菌门(Acidobacteria)对养分要求不高][37]，而拟杆菌门(Bacteroidetes)在营养丰富的土壤中更占优势[38-39]。这主要是因为除了土壤养分外，森林生态系统在不同的季节温湿度会存在显著差异，也会对细菌群落丰度产生影响。已有的研究证明，土壤微生物的季节性变化与土壤温度和湿度的季节性变化有关[9]。但在本研究中土壤温度对土壤细菌的影响小于土壤含水量，这与南方红壤丘陵区土壤细菌群落与温、湿度相关性一致[12]。由RDA分析可知，土壤水分是影响细菌群落季节性变化的主要因素，土壤水分对细菌群落影响的机理还需进一步深入研究。由此可以看出，在秦岭地区细菌群落组成的季节性变化是由土壤养分和温、湿度共同作用的结果。