沈莉 ，白晓丹 ，高雅 ，张光银 ，袁卓 ，徐士欣

（1．天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2．天津中医药大学，天津 301617）

缺血性脑卒中后情感障碍是脑卒中常见的并发症之一，主要包括脑卒中后焦虑、抑郁或抑郁/焦虑共病等，发生率为20%～65%，对脑卒中患者的功能康复产生了严重的影响，显著增加脑卒中后患者的致残率和病死率[1]。脑卒中的高致残率对患者身心损害巨大，加上脑部本身的损害对精神状态的影响，使卒中后焦虑（PSAD）的发病率进一步升高[2-3]。虑烦汤是天津市名中医颜红教授依据临床用药经验，遵循中医药理论研发出的治疗焦虑障碍的中药制剂，在10余年治疗焦虑障碍相关疾病中取得了良好的临床疗效[4]。前期研究结果表明，虑烦汤可明显改善患者的躯体焦虑症状，患者服用虑烦汤后纳差、腹胀、口干、易汗出、心悸等症状明显减轻，可能与调节T淋巴细胞、去甲肾上腺素（NE）以及5-羟色胺（5-HT）水平有关[5-6]。有研究提示，卒中后焦虑障碍，常常以躯体化焦虑为主[2]。本研究基于以上认识，建立大鼠脑缺血后焦虑复合模型，通过高架十字迷宫，旷场实验、明暗箱实验以及Morris水迷宫等行为学实验，以初步评价虑烦汤不同剂量对脑缺血后大鼠焦虑行为学的改善作用，为以后进一步研究中医药抗焦虑的临床效应提供参考。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级雄性健康SD成年大鼠60只，体质量（210±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0006。将实验动物饲养于中国医学科学院放射医学研究所SPF级动物实验室，12 h昼夜节律，正常光照时间12 h/d，室内温度控制在22～24℃之间，相对湿度保持在40%～60%之间，提供独立饲养空间，单笼饲养，保持安静环境。大鼠保持充足的饲料饲养，自由摄食饮水，所有物品均定期清洁消毒。实验流程均严格按照中国医学科学院放射医学研究所实验动物管理条例进行操作，实验动物均给予人道主义关怀，且严格遵循实验动物法管理条例。

1.2 实验药物与试剂 虑烦汤由柴胡10 g，淡豆豉10 g，生栀子 10 g，生地 10 g，赤芍 10 g，煅磁石 30 g，生龙齿 30 g，炒枳壳 10 g，白芍 10 g，牡丹皮 10 g，黄连 6 g，莲子心 10 g，百合 30 g，远志 10 g，夜交藤30 g，茯苓20 g组成，原药材由天津中医药大学第一附属医院药剂科提供，每剂药煎煮300 mL。过滤，滤液浓缩至含生药2 g/mL，并滤过除菌，保存备用。盐酸丁螺环酮片（北大医药股份有限公司，国药准字H19990302），水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司批号20171222）。

1.3 仪器与设备 硅胶线栓（L3600-AAA，广州佳灵生物科技有限公司），高架十字迷宫实验装置、旷场行为观察箱（100 cm×100 cm×50 cm）、明暗箱（40 cm×25 cm×25 cm）均由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供。Morris水迷宫购自淮北正华生物仪器设备有限公司（型号：Morris型），Anymaze动物视频行为学观察及自动分析系统（含计算机、摄像监控及Anymaze行为学分析软件）由上海欣软信息科技有限公司提供。

2 方法

2.1 大鼠卒中后焦虑复合模型制备 大鼠适应性饲养1周后，进行模型制备。参照Longa方法[7]，应用改良的线栓法永久性阻断大鼠左侧大脑中动脉，制作SD大鼠永久性脑缺血卒中动物模型（MCAO）。术后采用Longa评分法[7]观察缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损情况。经过神经功能评分合格的MCAO大鼠在SPF实验环境中单笼饲养5 d以适应环境。适应期结束后，开始进行持续7 d的定时喂水训练，即每日 9∶00—9∶10 和 21∶00—21∶10 固定时间段给大鼠两次饮水，每次持续10 min，其余时间撤掉水瓶不给水，并将水瓶放在大鼠看不见的位置。训练7 d后开始应激实验，即在第8天晚21∶00-21∶10开始进行时长为14 d的空瓶刺激[8-9]。具体方法：模型组大鼠在规定的喂水时间段施加无规律的空瓶刺激使得大鼠产生情绪应激反应，空瓶刺激每日进行1次或者每2日1次；空白组大鼠进行模型构建期间给予定期喂水，与喂水训练相同。整个实验期间，所有实验动物自由取食，并观察大鼠在空瓶刺激前后体质量的变化情况。详细的空瓶刺激实验方法，见表1。

2.2 分组与给药 复核因素造模后死亡9只大鼠，经高架十字迷宫实验筛选，剔除3只既未进入开放臂，也未进入封闭臂的大鼠，2只反复跌落高架的大鼠，最终选出36只SPF级的雄性健康SD成年大鼠作为进一步研究药物治疗的对象。将36只大鼠称体质量编号1-36号，再根据体质量随机分为4组，每组9只。各组分组及处理方法如下：模型组、丁螺环酮组、虑烦汤低剂量组、虑烦汤高剂量组，加上原有的空白组共计5组46只实验大鼠，分组完成后记录体质量。空白组和模型组不进行药物干预。其余3组大鼠在每日接受药物干预：丁螺环酮组每只大鼠以盐酸丁螺环酮3 mg/（kg·d）剂量灌胃[10]；虑烦汤低剂量组和虑烦汤高剂量组大鼠分别给予虑烦汤1.6 g/（kg·d）和3.2 g/（kg·d）剂量灌胃，空白组按相同剂量给予稀释药物用的灭菌纯净水。每日灌胃1次，共灌胃2周。

2.3 高架十字迷宫实验 实验在安静无干扰的环境下进行。首先在计算机中设定好高架十字迷宫的开放臂、闭合臂、中央区的区域范围大小和大鼠的编号。将大鼠轻柔抓起置于迷宫中央区域，使其头部正对其中一个开放臂，与此同时计算机软件开始运行，开启计时、摄像并实时跟踪记录大鼠5 min内分别进入开放臂的次数（OE）在开放臂滞留时间（OT）和进入开放臂和封闭臂的总次数（TE），由上述指标计算出：1）开放臂滞留时间的比例（OT%）：OT%=OT/300×100%。2）开放臂进入次数的比例（OE%）：OE%=OE/TE×100%。每只大鼠测试1次，所有大鼠行为学测试在每次测试完后用75%乙醇擦拭测试装置，清除粪便，消除气味，以便进行下一只大鼠的测试。

2.4 明暗箱实验 在实验开始前，设置计算机，先将大鼠放入另一动物盒中，任由其自由探究5 min，之后将大鼠轻柔抓起置于明箱中央，使其背朝通道，记录5 min内大鼠的活动情况，并记录大鼠在明箱运动距离（mm），进入明箱次数（T）和进入明箱时间（s）。实验在安静无干扰的环境下进行，每只大鼠只测试1次，每次测试1只大鼠。

2.5 旷场实验 将大鼠轻柔抓起置于旷场实验箱正中格，开启摄像机记录5 min内大鼠的活动情况。观察的指标：1）大鼠运动总路程；2）大鼠进入中央区时间；3）大鼠进入中央区次数。实验环境要求安静无干扰，每只测试1次，每次测试1只大鼠。

表1 空瓶刺激安排表Tab.1 Uncertain empty bottle stimulation schedule

2.6 Morris水迷宫实验 所有组别大鼠在以上各项行为学检测结束24 h后采用Morris水迷宫进行学习记忆功能的检测，参照Heo等[10]方法，实验检测的具体步骤分为两个主要阶段：1）寻找平台训练：将大鼠放置于平台熟悉30 s后，从目标象限以外的任意象限入水点各入水训练1次，每次训练间隔约为1～2 h，持续训练5 d。2）空间探索实验：在大鼠训练5 d后撤除平台，将大鼠从距离目标象限最远的入水点放入水中，观察并记录120 s内其搜索原平台的游泳轨迹，记录大鼠在空间探索阶段的总运动距离（mm），靶象限活动距离（mm）和靶象限活动时间（s）作为评价大鼠运动能力及记忆能力的指标。

2.7 统计学方法 采用SPSS 25．0统计软件进行分析，数据分析结果采用均数±标准差（±s）表示，干预前后的比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

3 研究结果

3.1 大鼠体质量变化情况 结果表明，模型组大鼠在MACO和慢性应激后体质量均有下降，经药物干预2周后大鼠体质量均有回升。与模型组比较，中药虑烦汤低剂量组和高剂量组大鼠均在治疗后体质量显著上升（P＜0．01），丁螺环酮组大鼠体质量也有所上升（P＜0．05）。见表 2。

表2 药物干预前后各组大鼠体质量变化情况（±s）Tab.2 Changes of body weight of rats in each group before and after drug intervention（±s）g

表2 药物干预前后各组大鼠体质量变化情况（±s）Tab.2 Changes of body weight of rats in each group before and after drug intervention（±s）g

注：与模型组比较，*P＜0．05，**P＜0．01；与治疗前比较，#P＜0．05，##P＜0．01。

组别 动物数 药物干预前 药物干预后空白组 10 238．50±3．24 260．70± 6．43##模型组 9 217．22±4．49 225．33± 3．81#丁螺环酮组 9 219．89±9．57 229．44± 9．22*##虑烦汤低剂量组 9 215．00±8．22 232．41± 8．35**##虑烦汤高剂量组 9 219．00±4．30 234．12±11．74**##

3.2 高架十字迷宫实验 与空白组比较，模型组大鼠开放臂进入时间比和次数比均减小，差异具有显著的统计学意义（P＜0．01）。高剂量虑烦汤能够显著提高开放臂进入次数比，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0．05）。与模型组比较，丁螺环酮组、虑烦汤低剂量组开放臂进入次数比无统计学差异（P＞0．05），但有促进大鼠进入开放臂进入次数的趋势。见表3。

表3 高架十字迷宫中各组大鼠行为学比较（±s）Tab.3 Behavioral comparison of rats in each groups in elevated plus maze tes（t±s）%

表3 高架十字迷宫中各组大鼠行为学比较（±s）Tab.3 Behavioral comparison of rats in each groups in elevated plus maze tes（t±s）%

注：与空白组比较，*P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．05。

组别 动物数 开放臂进入时间比 开放臂进入次数比空白组 10 43．10±19．51 48．60±13．70模型组 9 17．78±15．55* 16．67±15．02*丁螺环酮组 9 24．00±18．91 22．22±14．15虑烦汤低剂量组 9 33．56±19．32 24．33±20．90虑烦汤高剂量组 9 36．00±27．25 37．56±22．17#

3.3 旷场实验 药物干预2周后大鼠旷场实验数据显示，模型组运动的总路程、进入中央区时间以及进入中央区次数均减少，与空白组比较，差异具有显著的统计学意义（P＜0．01）。与模型组比较，丁螺环酮组（P＜0．05）、烦汤低剂量组（P＜0．05）和虑烦汤高剂量组（P＜0．01）大鼠进入中央区时间均有所提高；与模型组比较，丁螺环酮组（P＜0．05）和虑烦汤高剂量组（P＜0．01）大鼠的运动路程均有所增加，而虑烦汤低剂量组未见统计学差异（P＞0．05）。在提高大鼠进入中央区次数方面，各给药组均无统计学差异（P＞0．05）。见表 4。

表4 药物干预后各组大鼠旷场实验数据比较（±s）Tab.4 Comparison of open field experiments of rats in each groups after drug intervention（±s）

表4 药物干预后各组大鼠旷场实验数据比较（±s）Tab.4 Comparison of open field experiments of rats in each groups after drug intervention（±s）

注：与空白组比较，**P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．05，##P＜0．01。

进入中央区次数（次）空白组 1 0 2 0 8 7 1．5 0±8 9 9 3．6 9 1 2 4．2 9±6 6．6 1 2．0 0±1．8 3模型组 9 2 5 1 5．7 3±1 1 2 7．2 8** 6．0 7±1 0．9 7**0．5 6±0．8 8**丁螺环酮组 9 8 6 5 7．7 3±4 2 0 0．8 4# 7 4．9 2±7 1．2 2# 0．7 8±0．6 7虑烦汤低剂量组 9 7 8 7 2．4 3±5 5 5 8．2 2 8 6．8 3±8 0．9 2# 1．0 0±1．0 0虑烦汤高剂量组 9 1 2 4 2 3．1 3±6 1 3 7．2 2##1 1 9．1 0±7 0．0 2##1．1 1±0．9 3组别 动物数 总路程（m m） 进入中央区时间（s）

3.4 明暗箱实验 与空白组比较，模型组大鼠进入明箱次数以及在明箱运动距离显著减少（P＜0．01）。与模型组比较，虑烦汤高剂量组大鼠进入明箱次数延长（P＜0．05）。丁螺环酮组和虑烦汤高剂量组大鼠在明箱运动距离显著延长（P＜0．05），与模型组比较，各组药物干预后，大鼠进入明箱时间无统计学差异（P＞0．05）。见表 5。

3.5 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫测试结果显示，与空白组比较，模型组大鼠在水迷宫中的总运动距离、靶象限距离以及靶象限活动时间均减少，差异具有统计学意义（P＜0．05 或 P＜0．01）。虑烦汤高剂量组延长了大鼠在水迷宫中的总运动距离，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0．05）。见表 6。

表5 明暗箱测试中各组大鼠行为学比较（±s）Tab.5 Behavioral comparison of rats in each groups in light-dark box test（±s）

表5 明暗箱测试中各组大鼠行为学比较（±s）Tab.5 Behavioral comparison of rats in each groups in light-dark box test（±s）

注：与空白组比较，**P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．05。

进入明箱时间（s）空白组 10 4．30±3．43 1 605．33±1 185．64 136．94± 92．45模型组 9 1．22±1．39** 268．82± 240．17**164．86±112．11丁螺环酮组 9 2．67±1．87 653．57± 283．57# 116．02± 71．24虑烦汤低剂量组 9 2．56±1．59 438．43± 345．19 134．30±101．09虑烦汤高剂量组 9 4．11±1．45#1 169．35± 757．97# 129．55± 69．34组别 动物数 进入明箱次数（次）明箱运动距离（mm）

表6 Morris水迷宫测试中各组大鼠行为学比较（±s）Tab.6 Behavioral comparison of rats in each groups in Morris water maze（±s）

表6 Morris水迷宫测试中各组大鼠行为学比较（±s）Tab.6 Behavioral comparison of rats in each groups in Morris water maze（±s）

注：与空白组比较，*P＜0．05，**P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．05。

靶象限活动时间（s）空白组 10 631．22±426．24 178．72±130．73 12．55±6．01模型组 9 210．62±110．84**69．74± 38．77* 7．61±2．67*丁螺环酮组 9 465．92±302．15 86．49± 60．09 8．18±4．55虑烦汤低剂量组 9 402．03±295．33 86．18± 92．14 7．91±4．96虑烦汤高剂量组 9 611．86±392．74#138．83±118．77 9．91±5．66组别 动物数 总运动距离（mm）靶象限距离（mm）

4 讨论

PSAD是一种常见的脑卒中并发症，其病因尚未完全明确，临床治疗方法也多种多样，由于其可严重影响患者的生活质量，近年来关于脑卒中后焦虑的研究也日益增多[11-12]。本院心身科应用虑烦汤在治疗焦虑相关疾病10余年，临床疗效显著[4]。虑烦汤选用柴胡疏肝解郁，生地养血益阴以柔肝；白芍养肝阴、平肝阳、调肝气，黄连、栀子、百合、莲子心清心除烦，茯神、夜交藤安心神、养心血，配以生龙齿、磁石宁心定志，滋阴潜阳。诸药合用，共奏宁心除烦、疏肝解郁之效，从而缓解焦虑患者坐卧不宁，紧张恐惧，多虑失眠等诸多症状[4，6]。

高架十字迷宫是焦虑行为学研究中应用最广泛的平台之一[13]。既往研究提示，大鼠在高架十字迷宫装置中会出现担心紧张，发作性惊恐等多种焦虑行为，本研究显示模型组大鼠开放臂进入时间比和次数比均减小，高剂量虑烦汤能够显著提高开放臂进入次数比。旷场实验是利用动物惧怕空旷环境但又喜欢探索的心理冲突，检测啮齿类动物的自发活动[14]，其中大鼠运动总路程反应了大鼠的活动度和兴奋性，大鼠进入中央区次数反应了大鼠对新环境的探究行为，大鼠进入中央区时间反应了大鼠对环境的适应度。本研究结果提示，模型组大鼠进入中央区的时间和进入中央区次数均见明显减少，提示大鼠出现对空旷场所恐惧的焦虑样行为。丁螺环酮、低剂量虑烦汤和高剂量虑烦汤均提高了大鼠进入中央区时间，高剂量虑烦汤提高了大鼠的运动路程。Morris水迷宫在啮齿动物的空间学习记忆能力评价中具有非常重要的地位[15]。Cechetti等[16]的研究结果表明MCAO大鼠记忆能力显著下降，本研究结果进一步提示，MCAO复合慢性空瓶应激可使大鼠出现明显的认知能力下降。以上数据提示在实验过程中，经过复合方法造模，大鼠出现了自主活动减少，紧张恐惧等焦虑的行为学现象。经药物干预后，大鼠自主活动和探索行为有所增加，与前期临床研究相符合。

焦虑障碍的发病机制复杂，包括神经递质学说、遗传学说以及神经内分泌学说等，本研究仅从焦虑行为学的角度进行了探讨，虑烦汤抗焦虑的物质基础研究尚有待于进一步探讨。