负载磁性氧化铁纳米粒子的脂质体的制备及评价

2021-01-25金哲浩崔云秋孙景鑫金光玉全姬善

延边大学学报（自然科学版） 2020年4期

关键词：普鲁士切片染色

金哲浩，崔云秋，孙景鑫，金光玉，全姬善*

(1.延边大学附属医院影像一科，吉林延吉 133002； 2.延边大学药学院，吉林延吉 133002 )

0 引言

1 材料与方法

1.1 实验材料

福尔马林、乌拉坦、多聚甲醛、抗坏血酸、六水三氯化铁和四水氯化铁均为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸羟胺、氯仿、甲醇、邻二氮菲、钼酸铵、无水醋酸钠、浓硫酸、高氯酸、乙酸、二甲苯、无水乙醇、硝酸铁(Ⅲ)九水合物、氨水、硝酸和二甲基亚砜均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；胆固醇，美国Avanti公司；蛋黄卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE -PEG2000)，日本精化株式会社；四甲基偶氮唑蓝，碧云天生物技术研究所； DMEM培养基、胰酶消化液，美国HyClon公司； RPMI -1640培养基，美国Gibico公司；胎牛血清，以色列BI公司； Sephadex G -50，美国Sigma -Aldrich公司；透析袋，美国光谱公司；苏木素(hematoxylin)、伊红(eosin)联合染色液(HE染色液)，上海源叶生物科技有限公司；普鲁士蓝试剂盒、中性树胶、磷酸缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)，索莱宝科技有限公司；石蜡，国药集团化学试剂有限公司.

BALB/c雌性裸鼠(5周龄)，在无特定病原体(specific pathogen free,SPF)的条件下饲养.SPC -A1细胞(人肺腺癌细胞)、HepG2细胞和SMMC -7721细胞(人肝癌细胞)购自上海吉凯基因科技有限公司.在培养箱(37 ℃，二氧化碳的体积分数为5%)内培养上述细胞，培养基中均加入体积分数为10%的胎牛血清和体积分数为1%的青霉素和链霉素.SPC -A1细胞和SMMC -7721细胞的培养基为RPMI， HepG2细胞的培养基为DMEM.

1.2 实验仪器

酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；BL -90 Plus型Zeta电位用粒度分析仪，美国Brookhaven仪器公司；超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物科技有限公司；X射线衍射仪，荷兰PANnlytical公司；Virtis台式冷冻干燥机，美国SP Scientific公司；临床3.0 T核磁共振扫描仪，德国西门子股份公司； U-1900型光束分光光度计，日本HITACHI有限公司；DW -86L80型超低温保存箱，浙江捷盛低温设备有限公司；荧光电子显微镜，日本Olympus有限公司；RCZ -6B3型旋转蒸发仪，上海黄海药检有限公司； DZF -6050型真空干燥箱，广州市深华生物技术有限公司；Vortex2圆周振荡器，德国IKA公司.

1.3 MION-LP的制备

参考文献[5]的方法合成MION.将1.960 8 g六水三氯化铁、0.718 g四水氯化铁溶于超纯水中，然后将其加入到由氮气保护的三口烧瓶中，并在搅拌下迅速注入4.8 mL氨水，反应30 min；将永久磁铁置于烧瓶下，静置，待上述体系分层后去除上清液；用超纯水多次清洗磁铁吸附物至清洗液pH=7;分离清洗液后在所得到的沉淀物中加入 0.1 mol·L-1的硝酸溶液(酸化)，然后在氮气保护和高速磁力搅拌下加入硝酸铁(Ⅲ)九水合物溶液；加热回流1 h(溶液颜色由棕黑色变成黄褐色)后去除上清液，并用超纯水将磁铁吸附物转移至截留相对分子质量为6 000～8 000的透析袋中；以0.01 mol·L-1的硝酸溶液作为透析液对所得沉淀物透析2 d即得MION.

参考文献[6]的方法制备MION -LP.将1.4 mg胆固醇、20.0 mg卵磷脂和3.6 mg DSPE -PEG2000溶于氯仿-甲醇(体积比为2∶3)中，然后利用旋转蒸发仪蒸发溶剂得磷脂膜；将装有磷脂膜的旋蒸瓶置于真空干燥箱内(40 ℃)干燥12 h，然后加入MION水溶液，并于40 ℃水浴条件下水化脱膜30 min；冰浴下利用超声波细胞粉碎仪的探针对水化液进行超声15 min，过滤(0.22 μm微孔滤膜)后即得MION -LP，并保存(4 ℃)备用.

1.4 MION -LP中含磷量的测定

将Sephadex G -50凝胶(作为柱填料)用超纯水充分溶胀后填充到2.5 mL注射器(去塞加滤板)中，然后用超纯水平衡30 min.吸取1 mL MION -LP 的水溶液置于已处理的凝胶柱中，用超纯水洗脱后将洗脱液收集至试管(刻度为0.5 mL)中并加入消化剂(消化剂的配置方法为：将140 mL的浓硫酸加入到盛有250 mL蒸馏水的500 mL容量瓶中，混合，冷却后加入70%质量分数的高氯酸32.5 mL，再用蒸馏水定容)；加热，消化至溶液澄清后将其放置至冷却；加入显色剂(其中a液为含2.5 g钼酸铵、8.2 g无水醋酸钠的1 000 mL混合溶液，b液为10%抗坏血酸溶液， a、b液为体积比为9∶1的混合液(现配现用))，在70 ℃水浴中加热10 min.测定含磷溶液的吸收度(700 nm处)，计算含磷量并绘制磷含量-洗脱液体积数的曲线.在分离后的MION -LP溶液中加入2%的乳糖(冻干保护剂)，混匀后将其放入冰箱(-80 ℃)内冷冻12 h，然后将其放入真空冷冻干燥机中干燥72 h即得MION-LP冻干粉.

1.5 MION -LP的包封率测定

分别吸取同体积分离后的MION -LP溶液和MION溶液，加入质量分数为10%的盐酸羟胺溶液，摇匀后加入质量分数为0.15%的邻二氮菲和1 mol·L-1乙酸溶液，并用蒸馏水定容.在510 nm波长下测定橘红色配合物的吸光度[7]，由此得到MION -LP 溶液中铁离子的质量浓度，然后用 MION -LP 溶液中的铁离子的质量浓度与MION溶液中铁离子的质量浓度的比值即可计算得到MION -LP溶液中MION的包封率[8].

1.6 MION -LP的体外评价

1)MION -LP的细胞毒性测定.将生长至对数期的细胞以2×104个/孔(HepG2细胞)和1×104个/孔(SPC -A1细胞和SMMC -7721细胞)的细胞密度接种在96孔板中.在37 ℃的培养箱内培养18～22 h后，分别加入不同铁离子浓度的MION和MION -LP溶液.在空白对照组中加入无血清的培养基，并在37 ℃下培养24 h.将MTT溶液加入到板孔中，然后将孔板用铝箔纸包裹后放入培养箱内孵育4 h；吸去上清液后加入二甲基亚砜溶液；使用酶标仪在490 nm下测定溶液吸光度(OD)，并利用OD实验与OD空白的比值计算细胞的存活率.

2) 细胞摄取MION-LP的测定.采用普鲁士蓝试剂盒对细胞内摄取的MION -LP进行染色，结果显示MION为蓝色.将细胞以6×105个/孔(HepG2细胞)和4×105个/孔(SMMC -7721细胞)的细胞密度接种于6孔板中，在培养箱内37 ℃培养18～22 h后分别加入铁离子质量浓度为8 μg·mL-1的MION -LP.在空白对照组中加入无血清的培养基，并在培养箱内37 ℃培养6 h后去除板孔中的游离药物及死细胞.每孔加入4%多聚甲醛(用于固定细胞)，静置30 min后除去多聚甲醛，再加入普鲁士蓝染色试剂盒中A1液和A2液的等体积混合液，染色30 min.使用PBS清洗细胞3次，然后在每孔中加入普鲁士蓝染色试剂盒中的B液，染色10 min.使用PBS清洗细胞3次，然后将6孔板置于荧光电子显微镜下观察并拍摄.

人工导播：课程录制可以根据需要进行人工导播的录制。系统可根据多种导播策略，对教师、学生、板书和教学视频资源进行无缝切换，使录制后的课件内容更加丰富，避免单一的场景。人工导播需要有协助讲课教师的人员来进行导播。

3) 体外MRI成像能力的检测.配制铁离子质量浓度为1、2、3、4、5、6、7、8 μg·mL-1的MION溶液和 MION -LP 溶液.将溶液置于离心管内，加入300 μL的热琼脂糖溶液，然后利用涡旋振荡器充分混匀溶液后冷却；取上清液进行MRI体外检测(自旋时间3 700 ms，回波时间117 ms，成像野12 cm×12 cm，层厚2 mm).

1.7 MION -LP的体内评价

将SPC -A1细胞接种于6只BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下.接种后的裸鼠在SPF条件下饲养，并定期观察裸鼠的生存条件、生长状况和测量裸鼠肿瘤大小(使用游标卡尺).肿瘤增长至约200 mm3(肿瘤体积=1/2×肿瘤的长×肿瘤的宽×肿瘤的高)时即表明荷瘤裸鼠模型建立成功.肿瘤增长至600 mm3时，将荷瘤裸鼠平均分为两组(空白对照组和 MION -LP 实验组).于荷瘤裸鼠腹腔注射1 mg·kg-1的20%乌拉坦.麻醉荷瘤裸鼠后，摆置俯卧位，并使用医用胶带将其四肢和尾部固定在纸板上.荷瘤裸鼠呼吸匀速后，将纸板置于膝关节线圈内，并依次扫描裸鼠的肿瘤横向位置.扫描结束后，对实验组荷瘤裸鼠的尾静脉注射MION -LP(剂量为30 mg·kg-1)，然后分别间隔0.5、1、 1.5、 2、 2.5、 3 h再次将裸鼠置于膝关节线圈内，并依次扫描(行常规T2WI扫描)裸鼠的肿瘤横向位置.将扫描数据收集到西门子工作站对肿瘤区域给药前后的组织信号强度进行测量.测量时以0.02 sq.cm大小为感兴趣区域(ROI)，取3次测量的平均值，并采用独立样本t检验进行分析.T2WI扫描的具体参数为：TSE序列，TE 117 ms, TR3100，反转角89°，层厚2 mm，矩阵256×1 256，体素0.3 mm×0.3 mm×0.9 mm.

1.8 荷瘤裸鼠的组织病理染色

1) HE染色荷瘤裸鼠组织.对荷瘤裸鼠进行MRI扫描后，剥离其肿瘤、肝脏和脾脏组织，并将各组织放入福尔马林溶液中对其进行固定、脱水、包埋、切片.将切片放置到恒温箱(60 ℃)过夜后再在室温下放置20 min，然后用二甲苯溶液浸泡(10 min)，乙醇溶液(体积分数分别为100%、95%、85%)梯度浸泡(每次浸泡3 min并用自来水冲洗10 min)，苏木素染色(自来水冲洗10 min)，伊红染色(2 min)，乙醇溶液(体积分数分别为5%、95%、100%)梯度脱水，二甲苯溶液浸泡(3 min)，中性树胶封片.在荧光显微镜下观察封片并拍摄图片.

2) 普鲁士蓝染色荷瘤裸鼠组织.荷瘤裸鼠组织经切片和脱蜡后，滴加普鲁士蓝试剂盒中A1和A2的混合液，避光50 min后用流水冲洗去余色5 min；滴加普鲁士蓝B液染色30 s，流水冲洗5 s去余色，然后依次将切片放入乙醇和二甲苯中脱水，中性树胶封片.在荧光显微镜下观察封片并拍摄图片.

2 结果与分析

采用共沉淀法合成MION，除去其中的小分子(采用截留相对分子质量为6 000～8 000的透析袋透析)后得到纯化的MION.图1为MION的X射线衍射图.由图1可以看出，MION的衍射峰出现在30.3(220)、35.6(311)、43(400)、53.8(422)、57.4(511)、62.7(440)处，这些峰与Fe3O4(反式尖晶石结构)的标准卡(JCPDS 01-085-1436)[6]中的特征衍射峰一致.

由MION的粒径图(图2(A))和Zeta电位图(图2(B))可知，MION的粒径为(43.79±1.08) nm， Zeta电位为(20.36±2.93) mV.由MION -LP 粒径图(图2(C))和Zeta电位图(图2(D))可知，MION -LP的粒径为(68.82±0.16) nm， Zeta电位为(-7.81±0.82) mV.MION -LP的粒径大于MION的粒径表明，LP的加入增加了MION的粒径.另外，MION -LP呈负电表明LP对MION进行了包覆.由MION和MION -LP的透射电子显微镜图(图2(E)和图2(F))可知，MION -LP呈球形，内部隐约可见MION的颗粒，这再次证明LP对MION进行了包覆.

采用葡聚糖凝胶柱层析法分离未被包覆的MION，得到含有MION -LP的洗脱液.根据比色法测定洗脱液中无机磷的质量.图3为MION-LP的磷脂洗脱曲线.由图3可以看出，第3次洗脱之后得到的洗脱液中磷含量低于0.5 μg，表明包封的脂质体在第3次洗脱后其大部分已经流出.因此，本文取前3次得到的MION -LP洗脱液作为活性测试样品.

以测定MION和MION -LP的铁离子的质量浓度(x)与吸光度(y)做线性回归，结果表明在0～2.5 μg·mL-1范围内，铁离子的质量浓度与吸光度呈线性关系，其回归方程为:y=0.194 5x-0.004 6,R2=0.999 8.在510 nm处测定MION -LP和MION溶液的吸光度，由此得到MION -LP和MION的铁离子的质量浓度分别为(64.57±0.15) μg·mL-1和71.24 μg·mL-1，经进一步计算得MION 的包封率为(90.64±0.21)%.

采用MTT法测定了MION和MION -LP在HepG2、SPC -A1和SMMC -7721 3种细胞中的毒性，结果如图4所示.由图4(A)可知，加入含有不同质量浓度铁离子的MION的无血清培养基对细胞进行培养时，3种细胞的存活率均在80%以上，这表明MION溶液对3种细胞的存活率未造成较大影响.由图4(B)可知，加入含有不同质量浓度铁离子的MION -LP的无血清培养基对细胞进行培养时，当铁浓度大于8 μg·mL-1时，细胞存活率低于80%，这表明MION -LP具有一定的细胞毒性.为避免MION -LP对细胞的毒性作用，选择铁离子的质量浓度为8 μg·mL-1的MION -LP对细胞进行了进一步的体外实验，并用普鲁士蓝染色实验对细胞摄取MION -LP的情况进行了观察.图5为MION -LP与HepG2、SMMC -7721孵育6 h后的染色图.由图5可以看出，两种细胞内均有较多的蓝染颗粒，这表明细胞摄取了较多的MION -LP，即MION -LP可增强MRI的成像效果.

由图6可知，随着MION和MION -LP中铁离子质量浓度的增加，MRI的信号逐渐降低.为了验证MION -LP在体内的成像效果，对荷瘤裸鼠的尾静脉注射了MION -LP，并对荷瘤裸鼠肿瘤部位进行了T2WI序列平扫，结果如图7(A)所示.由图7(A)可以看出，随着对裸鼠肿瘤部位扫描时间的增加，其图像逐渐成灰色.为对比肿瘤区域给药前后的组织信号强度，以0.02 sq.cm大小为ROI，对所得数据进行了独立样本t检验，结果如图7(B)所示.由图7(B)可以看出，给药后3 h内的ROI信号强度与给药前的ROI信号强度相比，给药后的ROI信号强度在统计学上呈显著性差异(*P<0.05).由此表明，对荷瘤裸鼠的尾静脉注射MION -LP后，MION -LP在肿瘤部位出现聚集，进而说明MION -LP对肿瘤部位具有一定的靶向性.

图8为肿瘤组织的染色图，其中图8(A)为空白对照组的HE染色，图8(B)为MION -LP实验组的HE染色，图8(C)为MION -LP实验组的普鲁士蓝染色.由空白对照组图8(A)和MION -LP实验组图8(B)中的HE染色可以看到，细胞排列杂乱，细胞核变大且形状不规则，核质比例失调，这表明成功建立了荷瘤裸鼠模型.由图8(C)可以看出，在经过普鲁士蓝染色的肿瘤切片内未观察到蓝染颗粒，说明MION经脂质体运输至肿瘤部位后，其又经过血液循环被送至其他组织中，即表明MION不会在肿瘤部位累积.

肝脏组织的HE染色和普鲁士蓝染色如图9所示.由图9(A)可以看出，肝脏组织结构正常，且切片内有肝脏特有的肝血窦结构，由此可确定切片为肝脏组织.肝脏组织的普鲁士蓝染色如图9(B)所示.由图9(B)可以看出，肝脏切片内有明显的蓝染颗粒，说明荷瘤裸鼠尾静脉注射的MION -LP已到达肝脏内.脾脏组织的HE染色如图9(C)所示.由图9(C)可以看出，脾脏组织结构正常，且切片内紫红色的部分为红髓，分散于红髓间的蓝色小点为白髓结构，由此可确定切片为脾脏组织.研究[10-12]表明，MION -LP被递送到肿瘤部位后，其经过血液循环到达肝脏和脾脏内后能够被肝脾库普弗细胞(Kupffer cell)吸收、清除.脾脏组织的普鲁士蓝染色如图9(D)所示.由图9(D)可以看出，脾脏切片内有明显的蓝染颗粒，说明在荷瘤裸鼠尾静脉注射的MION -LP已到达脾脏内并被代谢.