蒙艳丽 徐慧星 王晓溪 宋亚娟 蔡萧君 王伟明

(黑龙江省中医药科学院， 哈尔滨 150036)

肺炎支原体肺炎(MPP)属于间质性肺炎，是肺炎支原体(MP)引起的以肺间质纤维结缔组织增生为主要病理改变的呼吸道感染性肺炎。慢性肺部疾病和免疫力低下人群对肺炎支原体易感，MPP占成年人肺炎的20%，儿童可达到40%[1]。肺炎支原体经呼吸道侵入后主要侵犯细支气管和支气管周围组织小叶间和肺泡间隔的结缔组织，慢性肺部炎症导致病变反复迁延，细胞外基质(ECM)的反复破坏、修复、重建和过度沉积而致间质纤维化，病理改变有间质性病变改变，多见斑片影、片状密度增高影，双肺均可受累[2]。

考虑到临床肺炎支原体易感于慢性支气管炎症患者，结合临床病因，建立慢性肺部炎症合并肺炎支原体肺炎实验动物模型[3]。首先使用烟雾对支气管黏膜进行刺激，经过反复刺激呼吸道，黏膜和纤毛损害，建立慢性肺部炎症模型[4-6]。损害的黏膜和纤毛易于肺炎支原体入侵，再通过给小鼠滴鼻肺炎支原体，建立肺炎支原体肺炎模型[7-8]。两种模型结合将建立一种新型肺部慢性炎症合并肺炎支原体肺炎模型，为后续的中药制剂芩百清肺浓缩丸等疗效提高和深度开发提供理论和实验根据。

1 材料与方法

1.1 菌株

肺炎支原体标准株(ATCC 15531)购自American Type Culture Collection，培养在胎牛血清中24 h后，放于含20%胎牛血清，10%酵母的PPLO培养基中生长，每隔7 d传代一次。

1.2 动物

100只BALB/c小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2015-0001。

1.3 主要试剂

PPLO 培养基 (Becton，Dickinson and Company，USA);酵母(安琪酵母股份有限公司);胎牛血清(Gibco，USA);苏木素、伊红染液(南京建成公司);Masson 三色染色试剂盒(Solarbio);TRIzol试剂(美国Invitrogen);One-step RT-PCR kit(Promega);肺炎支原体核酸定量检测试剂盒(中国达安基因)。

1.4 主要仪器设备

KD-TS3A自动组织脱水机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)；KD-BM生物组织包埋机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)；RM2235组织切片机(德国莱卡)；BX4-1生物显微镜(OLYMPUS公司)；Infinite M200 型多功能酶标仪(瑞士TECAN公司)；9 600 荧光定量PCR仪(杭州博日有限公司)；MDF-382E -80 ℃低温冰箱(日本SANYO公司)；ST-16R型低温高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；LXJ-n型普通低速离心机(上海医用分析仪器厂)20 μL、200 μL、1 000 μL微量加样器(Eppendoff 公司)；BP211D分析天平(Sartorius公司)。

1.5 方法

1.5.1动物模型建立：30只20～22 g的BALB/c小鼠，随机分为3组，烟熏并感染组(烟熏并肺炎支原体感染)10只，感染组(肺炎支原体感染)10只，空白组10只。烟熏并感染组小鼠使用国家发明专利仪器啮齿类动物呼吸系统暴露染毒装置烟熏10 d，每天2次，每次30 min。10 d后烟熏并感染组和感染组小鼠乙醚麻醉，移液枪吸取20 μL 106CCU/mL肺炎支原体液，抓取小鼠通过小鼠自然吸气鼻吸入液体，连续3 d。空白组则吸入同体积的MP液体培养基。结束后将小鼠断髓处死，分离肺组织，左肺组织10%甲醛固定，用于HE染色、右肺组织进行支原体检测Realtime PCR实验。实验重复3次。

1.5.2Realtime PCR：应用肺炎支原体核酸定量检测试剂盒进行肺炎支原体基因拷贝数测定，参照张越华和郑秀青文献优化实验条件[9]。各组肺组织匀浆后，吸取10 uL匀浆液，再加入等量DNA 提取液充分混匀，在100 ℃恒温处理10 min；12 000 r/min离心5 min，取上清备用。取PCR 反应管，加入处理后的样品、阴性质控品、MP弱阳性、MP强阳性质控品及不同浓度的MP阳性定量参考品上清液2 μL，8 000 r/min离心数秒，放入PCR仪器样品槽。按对应顺序设置位置，循环条件设置：93 ℃ 2 min； 93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10个循环；93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s，30个循环。有效检测剂量为>103基因拷贝/mL。

1.5.3HE染色：检测组织结构改变的最常规方法。肺组织放于10%甲醛中固定48 h以上，脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、水化后，用苏木素和伊红染色，脱水，中性树胶进行封片。肺组织切片HE染色，细胞核被染成蓝色，细胞质、结缔组织和肌肉等均被染成不同程度的红色，在光学显微镜下观察肺组织病理的变化。病理评分为0(没有改变)～16(最大改变)，按毛细支气管炎、血管周围炎、间质性肺炎和肺泡炎从轻到重定为1～4分。

1.5.4Masson染色：Masson染色是结缔组织染色最经典的一种方法，主要用于显示组织中纤维。肺组织放于10%甲醛中固定48 h以上，脱水、透明、包埋、石蜡切片脱蜡，苏木精染液5～10 min，充分水洗，盐酸酒精分化，Masson 丽春红酸性复红液5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钼酸水溶液分化3～5 min，直接用苯胺蓝液染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

1.6 统计方法

统计分析为单因素方差分析方法分析组间差异，相关数据用“均数±标准差”表示，数据统计采用SPSS 17.0统计软件进行分析，显著差异P<0.05。实验重复3次，每次实验取平均值，三次重复平均值结果进行统计分析。

2 结果

2.1 肺炎支原体基因拷贝数测定

实验使用肺炎支原体核酸定量检测试剂盒，检测肺上清液中的肺炎支原体DNA,见表1。大于103基因拷贝/mL为有效检测剂量，重复3次实验PCR结果统计看出，烟熏并感染组小鼠肺炎支原体感染率为93%，高于感染组77%；空白组小鼠感染率为0%，见图1。结果证明与空白组比较，烟熏并感染组和感染组均有显著性差异，P<0.05。烟熏并感染组优于感染组。

2.2 肺组织病理检查

HE染色显示空白组小鼠肺组织形态无异常改变，结构清楚，肺泡腔完整，排列规则，无炎细胞浸润。感染组小鼠肺组织上皮细胞脱落，支气管间隙增厚，肺泡壁毛细血管中有过量的红细胞，肺泡壁与间隔有大量炎性细胞浸润，肺泡壁塌陷，可发生灶性肺不张。烟熏并感染组小鼠肺组织细胞形态发生明显变化，表现为肺泡壁明显增厚，塌陷严重，肺泡腔排列不规则，部分肺泡腔闭塞使肺组织呈片状密度增高的致密结构，与正常肺组织的分界非常明显，有些肺组织充斥大量红细胞，见图2A。

表1 空白组、感染组、烟熏并感染组小鼠肺炎支原体基因拷贝数

图1 空白组、感染组、烟熏并感染组小鼠肺炎支原体感染率

图2 空白组、感染组、烟熏并感染组小鼠病理HE染色及评分结果 (×200)

从3次重复实验病理评分可知，烟熏并感染组在毛细支气管炎、血管周围炎、间质性肺炎和肺泡炎等症状上较感染组损伤严重。与空白组比较，烟熏并感染组和感染组均有显著差异，见图2B。(P<0.05。)

2.3 肺组织纤维化实验

小鼠肺组织Masson染色表明，空白组小鼠肺组织无或极少有胶原纤维形成，肺结构清晰可见，排列规则；感染组小鼠肺组织的小叶间质以及血管周围、细支气管周围有大量蓝染的胶原纤维，呈现细丝状；烟熏并感染组小鼠蓝色区域即胶原纤维明显增多呈现带状，实验重复3次。见图3。

图3 空白组、感染组、烟熏并感染组小鼠病理Masson染色结果 (×200)

3 讨论

药物临床前研究是新药研发的重要阶段,是评价药物有效性和安全性的基础工作,临床前研究结果的准确性和可靠性,是保证药物研发成功和降低临床研究风险的重要措施。药物的临床前研究主要是指使用非人类模式生物或实验动物进行的研究,通过不同的动物模型和实验方法,评价药物的药效。实验动物模型是研究的最常用的方法，能为我们解析重大人类疾病机理,发现新药作用靶点和新型药物的创制。目前没有慢性肺部炎症合并肺炎支原体肺炎模型建立方法的报道，参照以往肺损伤动物模型[10]及鼻滴入感染方法建立肺炎支原体肺炎动物模型[11-12]，考虑到肺炎支原体的感染特点即易感于慢性肺部炎症人群[13]，本论文改进动物造模方法，模拟临床病因建立慢性肺部炎症合并肺炎支原体肺炎模型[14-15]。

烟雾对支气管黏膜反复刺激，损害黏膜和纤毛，易于肺炎支原体黏附，加重肺炎支原体肺炎。实验结果表明，支原体检测试剂盒检测，发现烟熏并感染组小鼠的支原体感染率明显高于正常感染组；通过HE染色，烟熏并感染组小鼠肺组织病理图片的细胞状态、轮廓、炎症变化都要比正常感染组的严重，表明烟熏并感染组小鼠的感染明显加重。Masson染色图片显示，烟熏并感染组小鼠胶原纤维大量增加，呈现宽带状或片状，其病变程度明显高于感染组。实验结果证明，烟熏并感染组小鼠与感染组小鼠比较，肺组织结构损坏严重，间质胶原纤维生成更加明显，肺炎支原体更加易感，这可能是慢性肺部炎症患者易于合并肺炎支原体肺炎，并反复迁延不愈原因。