孙秀英，袁颖，徐彧

南京医科大学附属淮安第一医院，江苏淮安223300

鼻咽癌是发生于鼻咽顶壁及咽隐窝的恶性肿瘤，全球每年鼻咽癌发病患者例数约8万，死亡例数约5万［1］。鼻咽癌对放化疗较为敏感，早期患者积极治疗后5 年生存率达80%，但中晚期患者肿瘤已发生局部浸润及远处转移，患者远期生存预后不佳［2］。因此，有必要深入研究鼻咽癌发生发展的机制，寻找诊断、治疗及预后判断的肿瘤标志物。微小RNA（miRNA）是长度为19～25 个核苷酸的非编码RNA分子。研究发现，miRNA 参与正常细胞增殖、分化、凋亡及代谢等生物学过程，与炎症、免疫及肿瘤等疾病的发生发展密切相关［3］。miR-10b 基因位于染色体2q31.1，在肾癌［4］、肝癌［5］等多种肿瘤中均存在异常表达，可调控下游靶基因如同源盒基因3（HOXA3）的表达，促进细胞侵袭和转移，导致肿瘤的恶性进展。鼻咽癌的发生与EB 病毒感染密切相关。潜伏期膜蛋白1（LMP1）是EB 病毒的基因蛋白产物，发挥癌基因的功能。有研究报道，LMP1 能够激活细胞内核因子κB信号通路，促进正常鼻黏膜上皮细胞的恶性转化，促进鼻咽癌的发生发展［6］。Twist 同系物 1（Twist1）基因位于 7p21.1，编码蛋白为具有螺旋―环―螺旋结构的转录因子，以同二聚体和异二聚体的方式发挥作用，在胚胎发育、神经管闭合和褐色脂肪代谢中起重要作用。Twist1 在肺癌［7］、肝癌［8］等多种人类癌症中过表达，可促进肿瘤细胞的侵袭和转移，导致肿瘤的发生发展。目前关于 miR-10b、LMP1 和Twist1 在鼻咽癌中的研究较少。因此，本研究通过观察鼻咽癌组织中miR-10b、LMP1和Twist1的表达变化，探讨三者表达的相关性及临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月—2019年12月南京医科大学附属淮安第一医院诊治的92 例鼻咽癌患者。纳入标准：经病理学检查确诊为鼻咽鳞癌，由两位病理医师共同诊断；初次诊治，未接受过化疗、放疗等治疗；临床资料及病理资料完整。排除标准：合并其他器官恶性肿瘤；合并严重感染性疾病；合并严重的心肺肾等脏器功能障碍。其中男52例，女40例；年龄 26～79（47.3 ± 6.1）岁；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期22 例，Ⅲ～Ⅳ期70 例；肿瘤分化程度：高中分化19 例，低分化73 例；伴淋巴结转移62 例，无淋巴结转移30例；有吸烟史31例，无吸烟史61例。患者及家属对本研究知情同意并签署知情同意书，本研究经我院伦理委员会审核批准通过。

1.2 组织中miR-10b、LMP1和Twist1 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。各取约50 mg 癌组织和癌旁组织（距离癌组织边缘2 cm 以上），TRIzol法提取组织中总RNA，Nanodrop 检测RNA 的浓度及纯度。以RNA 为模板逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR 总反应体系20 µL，10 µL SYBR Green Pre⁃mix，上下游引物各1µL，模板2µL，去离子水6µL。miR-10b 上游引物序列：5"-CTCAACTGGTGTCGTG⁃GAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAAATT-3"，下 游引物序列：5"-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3"，内参基因U6 上游引物序列：5"-TTCGGCAGCA⁃CATATACTAAAATTGG-3"，下游引物序列：3"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5"；LMP1 上 游 引物序列：5"-ACACACTGCCCTGAGGATG-3"，下游引物序列：5"-TGAGCAGGAGGGTGATCA-3"；Twist1 上游引物序列：5"-CAAGCTGCAGCTATGTGGC-3"，下游引物序列：5"-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGG-3"；内参基因GAPDH 上游引物序列：5"-GCTCTCT⁃GCTCCTCCTGTTC-3"，下 游 引 物 序 列 ：3"-CGCCCAATACGACCAAATCC-5"。 miR-10b 的 反 应条件：95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。LMP1、Twist1 反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，58 ℃退火25 s，70 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以 2-ΔΔCt法计算miR-10b、LMP1和Twist1 mRNA的相对表达量。

1.3 组织中LMP1、Twist1 蛋白表达检测 采用免疫印迹法。各取约50 mg 癌组织和癌旁组织，将组织冰上剪碎，组织匀浆器匀浆，将上清加入细胞裂解液，裂解15 min。取上清蛋白定量后，加入上样缓冲液，99 ℃水浴10 min。进行SDS-PAGE 胶电泳：浓缩胶恒压80 V，分离胶恒压120 V，恒压80 V 转印2 h。将PVDF 膜放入5%脱脂牛奶中封闭2 h；LMP1、Twist1一抗（稀释比均为1∶3 000，LMP1单抗购自In⁃vitrogen 公司，Twist1 单抗购自abcam 公司）4 ℃孵育过夜；二抗（1∶5 000）中孵育，室温1 h。ECL 暗室显影照相。出现相应蛋白条带判定为阳性，无蛋白条带判定为阴性。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；miR-10b、LMP1 和 Twist1 mRNA 表达的相关性采用 Pear⁃son线性相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌组织和癌旁组织中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA 表达比较 鼻咽癌组织中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA 的相对表达量分别为8.110±1.132、4.934 ± 0.826、4.147 ± 0.811，癌旁组织分别为0.475±0.113、0.627±0.151、0.568±0.105。鼻咽癌组织中 miR-10b、LMP1 和 Twist1 mRNA 的相对表达量均高于癌旁组织（t分别为64.373、49.198、41.978，P均<0.01）。

2.2 鼻咽癌组织和癌旁组织中LMP1和Twist1蛋白表达比较 鼻咽癌组织及癌旁组织中LMP1 蛋白表达阳性率分别为77.2%（71/92）、10.9%（10/92），癌组织LMP1 蛋白表达阳性率高于癌旁组织（χ2=82.065，P<0.01）；癌组织及癌旁组织中Twist1 蛋白表达阳性率分别为72.8%（67/92）、7.6%（7/92），癌组织Twist1 蛋白表达阳性率高于癌旁组织（χ2=81.376，P<0.01）。

2.3 鼻咽癌组织中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA表达与临床病理特征的关系 不同肿瘤TNM 分期鼻咽癌患者癌组织中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA 表达比较差异有统计学意义（P均<0.05）。见表1。

2.4 鼻咽癌组织中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA表达的相关性 鼻咽癌癌组织中miR-10b 与LMP1、Twist1 mRNA 的表达呈正相关（r分别为 0.603、0.578，P均<0.01），癌组织中LMP1 与Twist1 mRNA表达呈正相关（r=0.611，P<0.01）。

3 讨论

鼻咽癌是我国常见的头颈部恶性肿瘤之一，源于鼻咽部及咽隐窝部黏膜上皮组织，病理上分为角化性、非角化性及基底样鳞状细胞癌三类。目前放疗是鼻咽癌的主要治疗方式，但放疗的不良反应较大，局部复发及转移率较高［9］。因此，需深入研究鼻咽癌的病因及发病机制，用于临床诊断及治疗。近年研究表明，细胞内存在的miRNA 可以通过结合下游靶基因mRNA 的3"-非编码区来调控多种靶基因的表达，而miRNA 的异常表达与自身免疫性疾病、心血管疾病及肿瘤等多种疾病有关，有望成为诊断治疗鼻咽癌的肿瘤标志物［10］。

miR-10b编码基因位于人类2q31 HOXD 基因簇中。近年来研究表明，乳腺癌等多种肿瘤中miR-10b 表达升高，并且体外试验亦证实过表达miR-10b具有促进肿瘤细胞的侵袭及转移的功能［11］。本研究鼻咽癌组织中miR-10b 的相对表达量高于癌旁组织，表明miR-10b 参与鼻咽癌的发病过程。有学者报道，miR-10b 的表达增加能够通过调控大肿瘤抑制激酶2（LATS2）的表达，促进肿瘤细胞的上皮间质转化，导致肿瘤细胞的恶性进展［12］。此外，鼻咽癌组织中miR-10b 的表达与肿瘤TNM 分期有关，表明miR-10b 高表达参与促进鼻咽癌的发生发展。其机制可能是miR-10b 作为一种致癌miRNA，能通过促进岩藻糖基转移酶8 的表达，进而激活蛋白激酶B信号通路促进肿瘤细胞的增殖及局部侵袭浸润，导致肿瘤分期升高［13］。此外，miR-10b 表达增加可通过抑制抑癌基因如同源性磷酸酶张力蛋白基因的表达，促进肿瘤细胞的无限增殖［14］。

表1 鼻咽癌组织中miR-10b、LMP1和Twist1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

EB 病毒具有嗜B 淋巴细胞的特点，人体感染后处于潜伏状态，在一定条件下能够再次复制，并编码产生蛋白抗原。LMP1 是EB 病毒编码产物，具有诱导B 淋巴细胞分化、促增殖及抑制凋亡的能力。有研究发现，LMP1 能够激活肿瘤细胞内经典的Wnt/β连环蛋白信号通路，促进肿瘤细胞的恶性增殖，促进鼻咽癌的发生发展［15］。本研究中，癌组织中LMP1 mRNA 表达和LMP1 蛋白阳性率均升高，表明LMP1可能参与鼻咽癌的发生发展。分析其原因，鼻咽癌是一种EB 病毒相关癌症，肿瘤发生时，处于潜伏状态的EB 病毒能够再次活化，诱导LMP1 的表达，从而促进肿瘤的恶性进展。此外，高分化期肿瘤中LMP1 表达较高。分析其原因，LMP1 充当组成型活性受体，模拟肿瘤坏死因子受体超家族分子功能，激活细胞内多种信号通路，包括核因子κB，磷脂酰肌醇3 激酶/Akt 和丝裂原活化的蛋白激酶途径等，促进基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子等癌基因的表达，导致肿瘤细胞发生迁移、增殖等恶性生物学行为［16］。

Twist1 基因的编码蛋白是一种重要的具有螺旋—环—螺旋结构的转录因子，以异二聚体的形式与DNAE 盒序列结合，调节神经发育、神经管闭合和褐色脂肪代谢等生物学过程。该基因在多种人类癌症中被高度甲基化并过表达，编码蛋白质促进肿瘤细胞的侵袭和转移。研究表明，肿瘤细胞中Twist1 表达上调促进肿瘤细胞发生上皮间质转化过程，导致肿瘤的恶性进展［17］。本研究中，鼻咽癌组织中Twist1 mRNA 表达和Twist1 蛋白表达阳性率均高于癌旁组织，表明Twist1 参与鼻咽癌的发病。研究表明，Twist1 表达受 miRNA（如 miR-140-3p）的调控，miR-140-3p 表达下调导致Twist1 mRNA 的稳定性增加，肿瘤中Twist1 表达升高，而Twist1 表达升高能够促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，增加肿瘤细胞的局部浸润及远处转移能力，促进肿瘤的恶性进展［18］。此外，Twist1 基因的表达与肿瘤分期有关，可能是因为过表达Twist1 导致E-钙黏素表达降低，波形蛋白等间质性标志物表达升高，促进鼻咽癌的恶性进展，导致肿瘤分期升高［19］；肿瘤中Twist1的表达上调能够通过增加性别决定区Y 框蛋白2 等因子的表达，增加肿瘤CD133+干细胞亚群，增强肿瘤的恶性增殖及迁移能力［20］。

本研究进一步分析了鼻咽癌组织中miR-10b、LMP1 和 Twist1 表达的相关性，结果显示 miR-10b 与LMP1、Twist1 的表达 呈 正相关，LMP1 的表达与Twist1 表达呈正相关。目前其机制尚不清楚，但有学者在鼻咽癌的C666.1 细胞系中发现，EB 病毒表达的LMP1 蛋白能够通过上调转录因子Twist1 的表达，而Twist1 结合miR-10b 的启动子区域，促进miR-10b 的表达［21］。也有研究发现，miR-10b 能够靶向抑制抑癌基因PTEN 的表达，促进恶性肿瘤细胞的增殖及迁移，导致肿瘤进展［22］。因此，鼻咽癌中LMP1可能通过促进Twist1 及miR-10b 的表达，促进鼻咽癌的发生发展，这可能是影响鼻咽癌发生发展的重要机制。

综上所述，鼻咽癌组织中miR-10b、LMP1 和Twist1 表达升高，三者表达与肿瘤分期有关。鼻咽癌组织中的miR-10b、LMP1 和Twist1 有可能成为新的鼻咽癌肿瘤诊断及治疗靶点，但三者的相互作用机制及临床意义尚需要进一步研究。