张金祝，李海德，尹桂华，姚宗芹，宋杰，赵蒙，赵明明

临沂市中心医院，山东临沂276400

扩张型心肌病是一类以心力衰竭、猝死、恶性心律失常为临床表现的常见心肌病，心肌纤维化是促进扩张型心肌病心功能恶化的关键因素［1］，逆转心肌纤维化可能是治疗扩张型心肌病的重要靶点。但是，扩张型心肌病心肌纤维化的发生发展机制目前尚不清楚。有研究表明，miRNA208a 在多种病因所致心肌纤维化的发生、发展中起重要作用［2-3］，但其对扩张型心肌心肌纤维发生发展的影响目前国内外文献鲜有报道。2018 年4—11 月，我们通过构建扩张型心肌病大鼠模型，探讨miRNA208a 对扩张型心肌病大鼠心肌组织中内皮素（ET）、肌球蛋白重链-β（MHC-β）、Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）等表达的影响，以期能部分阐明扩张型心肌病心肌纤维化发生发展的机制，从而为逆转该病理变化提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性 Wistar 大鼠 30 只，7 周龄，体质量220～240 g，购自山东省动物实验中心；阿霉素（10 mg/每瓶）购自北京嘉林药业有限公司；兔抗大鼠多克隆抗体、HE 染色试剂盒、Masson 染色试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自武汉博士德公司；动物高分辨彩色超声仪器（Visualsonics，Canada）。

1.2 动物模型制备及分组处理 采用连续腹腔注射阿霉素法制备扩张型心肌病大鼠模型，剂量为2.5 mg/kg，共注射6 周［4］。模型制备成功后，随机分为 mut-miRNA208a 组 、antagomiRNA208a 组 、premiRNA208a 组，每组10 只。分别转染含突变miR⁃NA208a、抑制 miRNA208a 表达、过表达 miRNA208a的腺相关病毒质粒。

1.3 心功能及心脏指数（HWI）检测 转染成功72 h后，应用动物心脏彩超获取各组大鼠心室舒张末期内径（LVEDD）、心室收缩末期内径（LVESD）、左心室射血分数（LVEF）数据。重新称量大鼠体质量后，2%戊巴比妥钠针左下腹腔注射充分麻醉，取出各组大鼠心脏，用生理盐水清洗，称量各大鼠心脏质量，计算HWI，HWI=心脏质量/体质量。

1.4 心肌组织HE 染色 4%甲醛溶液固定心肌组织，石蜡包埋，切片。石腊切片依次放入二甲苯、乙醇脱蜡、蒸馏水浸洗后，苏木紫染色，0.1%盐酸乙醇分化。浸泡伊红液染色，风干后中性树胶封片，镜检观察。

1.5 心肌组织Masson 染色 石蜡切片常规脱蜡至水洗，Weigert 铁苏木精染液染核，1%盐酸乙醇分化，丽春红酸性品红染液染色；1%磷钼酸溶液分化，甩干，苯胺蓝染液复染；1%冰醋酸冲洗切片，快速水洗后，乙醇脱水，二甲苯透明、风干后中性树胶封片，镜检并摄片。随机选取5个视野，Olympus-BX50 显微镜摄像系统摄像观察

1.6 心肌组织ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表达检测采用RT-PCR 法。TRIzol 法提取心肌组织总RNA，严格按RT-PCR 试剂盒说明操作。选择ET、MHC-β、COL-ⅠRNA 相应引物序列，RT-PCR 反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；40 个循环。绘制溶解曲线，心肌组织ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表达最终数据以 2-ΔΔCt进行分析。

1.7 心肌组织ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表达检测采用Western blotting 法。石蜡组织切片脱蜡后行抗原修复封闭，然后分别滴加兔多抗GAPDH 抗体（1∶1 000 稀释）、鼠单抗ET（1∶1 000 稀释）、鼠单抗 MHC-β（1∶500 稀释）、鼠单抗COL-Ⅰ（1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜，TBST 洗去多余一抗后分别滴加封闭液稀释（1∶50 000 稀释）的HRP 标记羊抗小鼠、羊抗兔二抗。TBST 洗去多余二抗后滴加工作液覆上保鲜膜，X 线胶片压片、显影、定影，冲洗胶片用Band Scan 分析胶片灰度值，获得心肌组织ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量数据用±s表示，三组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能及HWI 各组大鼠HWI、LVEDD、LVESD、LVEF 比较，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表1。

表1 三组大鼠心功能及HWI比较（±s）

表1 三组大鼠心功能及HWI比较（±s）

注：与mut-miRNA208a组比较，*P<0.05；与antagomiRNA208a组比较，#P<0.05。

组别mut-miRNA208a组antagomiRNA208a组pre-miRNA208a组n 10 10 10 HWI（mg/g）2.82±0.16 2.57±0.96*3.30±0.21*#LVEDD（mm）7.73±0.33 6.96±0.35*7.94±0.29*#LVESD（mm）4.02±0.41 3.42±0.25*4.38±0.24*#LVEF（%）72.0±1.61 76.1±1.16*69.3±1.54*#

2.2 各组大鼠心肌组织染色 HE 染色显示，mutmiRNA208a 组、pre-miRNA208a 组大鼠心肌纤维排列紊乱，细胞间质模糊，细胞肥大、水肿；antagomiR⁃NA208a 组大鼠仍见细胞肥大、水肿，但心肌纤维排列稀疏，走形基本正常。Masson 染色显示，心肌胶原纤维呈蓝色，胞质呈红色，胞核呈蓝黑色；mutmiRNA208a 组心肌间质见大量胶原纤维分布，premiRNA208a 组较mut-miRNA208a 组胶原纤维显著增多，而antagomiRNA208a 组心肌间质胶原纤维含量降低。

2.3 三组大鼠心肌组织ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表达 三组大鼠心肌组织ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表达差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表2。

表2 三组大鼠心肌组织ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表达比较（-x± s）

2.4 三组大鼠心肌组织ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表达 三组大鼠心肌组织ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表达差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠心肌组织ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表达比较（±s）

注：与mut-miRNA208a组比较，*P<0.05；与antagomiRNA208a组比较，#P<0.05。

组别mut-miRNA208a组antagomiRNA208a组pre-miRNA208a组n 10 10 10 ET 蛋白0.37±0.024 0.15±0.005*0.94±0.025*#MHC-β蛋白0.45±0.010 0.22±0.008*0.83±0.004*#COL-Ⅰ蛋白0.28±0.016 0.13±0.001*0.46±0.012*#

3 讨论

扩张型心肌病是慢性心力衰竭的重要病因，严重影响患者的生活质量和预期寿命，其主要病理生理变化为由心肌纤维化和心肌细胞受损所致的心肌重构。心肌纤维化主要表现为心肌间质内广泛的异常纤维组织（主要为COL-Ⅰ、COL-Ⅲ）沉积。这些异常沉积的胶原蛋白可增加心肌的僵硬度，降低心室的舒张功能［4］。研究表明，在射血分数保留的心力衰竭类型中，COL-Ⅲ更能增加心室壁的僵硬度［5］；而这些异常排列的胶原蛋白和心肌细胞会直接损害心肌的收缩能力，促进心肌射血分数减退，导致心力衰竭的发生、发展［6］。ET 由血管内皮细胞产生，具有调控心肌成纤维细胞，直接刺激胶原蛋白沉积的作用［7］；MHC-β突变是扩张型心肌病的重要病因。

miRNA208a 是 miRNA208 家族一员，由 MHC-β基因编码，特异性表达于心肌组织。本研究HE 染色显示，mut-miRNA208a 组、pre-miRNA208a 组大鼠心肌纤维排列紊乱，细胞间质模糊，细胞肥大、水肿；antagomiRNA208a 组大鼠心肌纤维排列稀疏，走形基本正常。Masson 染色显示，mut-miRNA208a 组心肌间质见大量胶原纤维分布，pre-miRNA208a 组较mut-miRNA208a 组胶原纤维显著增多，而an⁃tagomiRNA208a 组心肌间质胶原纤维含量降低。过表达miRNA208a 可使扩张型心肌病模型大鼠心肌组织中 ET、MHC-β、COL-Ⅰ高表达，而抑制 miR⁃NA208a 的表达则可使扩张型心肌病模型大鼠心肌组织中ET、MHC-β、COL-Ⅰ表达减低，模型大鼠心功能得到改善。这提示miRNA208a可能通过或至少部分通过作用于其靶标ET、MHC-β而促进COL-Ⅰ高表达，从而导致模型大鼠心功能恶化。既往研究也表明，miRNA208a 促使心肌梗死模型大鼠心肌纤维化，而降低miRNA208a 的表达可减轻心肌纤维化的程度［3］。另有研究显示，抑制miRNA208a 的表达可减轻高盐饮食大鼠心肌肥厚及周围血管纤维化程度［8］。机械牵张H9C2 细胞可通过TGF-β1刺激miRNA208a的表达，从而促进心肌细胞肥大及ET、COL-Ⅰ生成［9］。miRNA208a 主要通过其靶标ET、MHC-β 发挥其致心肌纤维化及心肌细胞肥大的作用［10］。研究显示，在老年心肌组织中内皮素可促进心肌成纤维细胞胶原蛋白合成［11］，而COL-Ⅰ的过量合成则导致心肌纤维化，导致心功能降低［12］，上述研究结果与本研究结果较一致。

综上所述，miRNA208a 在扩张型心肌病心肌组织纤维化中起重要作用。抑制心肌miRNA208a 的表达则可降低心肌组织中ET、MHC-β、COL-Ⅰ的表达，改善大鼠心功能。miRNA208a 可能是治疗扩张型心肌病的重要靶标。