曾保征，王赣 ，陈超，黄远丽，董超

1 麻城市人民医院，湖北麻城438300；2 华中科技大学同济医学院附属荆州医院

肝细胞癌（HCC）是人类常见的原发恶性肿瘤之一，具有高侵袭性的特点，患者的5 年生存率低于10%，病死率居全球肿瘤的第三位［1］。虽然近年来外科手术和药物治疗取得了明显的进步，但HCC 患者的生存率仍没有得到有效提高，患者预后仍然较差。HCC 的发生发展机制复杂，研究显示许多信号转导通路均参与其中，但目前具体机制尚不清楚，尚缺乏能够有效抑制肿瘤的药物［2］。研究显示，具有高度保守性的miRNA 在机体众多信号转导通路的调控中发挥重要作用，miRNA 能够通过靶向调控靶基因的表达，参与恶性肿瘤的发生、进展。据报道，miR-138 在恶性肿瘤生长、耐药、侵袭转移、细胞自噬方面均发挥着重要的作用［3］。既往研究发现miR-138 在HCC 患者血清中表达明显降低，但具体作用机制尚不清楚［4］。因此，本研究采用qRT-PCR检测miR-138 在HCC 组织及细胞中的表达变化，并进一步观察其对HCC 细胞侵袭、迁移能力及上皮间质转化（EMT）的影响，为HCC 治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料 收集 2016 年 7 月—2018 年 6 月在麻城市人民医院行手术治疗的60 例HCC 患者的癌组织及相对应的癌旁组织标本。60 例癌组织经术后病理证实均为HCC 组织，癌旁组织标本均为无肿瘤细胞侵犯的正常组织。术前所有患者未进行任何抗肿瘤治疗。60 例患者中，＜50 岁 17 例，≥50 岁 43 例；男44 例，女 16 例；肿瘤直径＜5 cm 23 例，≥5 cm 37 例；TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期 19 例，Ⅲ、Ⅳ期 41 例；Edmondson病理分级Ⅰ、Ⅱ级32 例，Ⅲ、Ⅳ级28 例；微血管侵犯26例，无微血管侵犯34例。本研究经过医院伦理委员会备案批准，所有患者及家属对本研究知情同意。miRNA分离纯化试剂盒购自美国Ambion公司；反转录试剂盒和qRT-PCR 检测试剂盒均购自美国Applied Biosystems 公司；所有引物购自广东锐博生物公司；TRIzol 试剂和Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen 公司；Matrigel 胶购自美国 BD 公司；Tran⁃swell 小室购自美国 Millipore 公司；miR-138 mimics及 NC-mimics 均购自上海吉玛公司；E-cadherin、Vi⁃mentin抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养及转染 高侵袭性人HCC 细胞系MHCC97H、低侵袭性人 HCC 细胞系 MHCC97L 和HepG2 以及正常人肝细胞系L02 均购自中国科学院上海细胞库，应用RPMI1640 培养基（含10%胎牛血清）在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每3 d 更换培养液1 次。转染操作时，将对数生长期的MHCC97H 细胞接种于6 孔细胞板，细胞分为miR-138 mimics 组 和 NC-mimics 组 ，分 别 应 用 Lipo⁃fectamine2000 将 miR-138 mimics 及 NC-mimics 转 染至MHCC97H 细胞，转染后6 h 更换为正常细胞培养液继续培养，取转染后24 h的细胞进行后续实验。

1.3 miR-138检测 采用qRT-PCR。应用miRNA分离纯化试剂盒提取HCC组织及癌旁组织、MHCC97H、MHCC97L、HepG2 及 L02 细胞的总 RNA，紫外分光度计测定浓度及纯度。取1µg 总RNA，应用反转录试剂盒反转录生成cDNA，反应条件：15 min 37 ℃，5 s 85 ℃。取 PCR 引物，以cDNA 为模板，按照 qRTPCR 反应试剂盒说明书配置反应液进行反应，miR-138 引物序列上游：5"-GGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3"，下游：5"-AACTTCACAACACCAGCTTA-3"。U6引物序列上游：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。 qRT-PCR 反 应条件：10 min 95 ℃；10 s 95 ℃，20 s 60 ℃，15 s 72 ℃，共进行 40 个循环。采用 2-ΔΔCt计算 miR-138 的相对表达量。

1.4 细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭实验。取转染后 24 h 的 miR-138 mimics 组和 NC-mimics 组MHCC97H细胞，对细胞预先饥饿处理24 h后，接种于预铺Matrigel胶的Transwell 小室上室内（含2×105个细胞），Transwell 小室下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置入细胞培养箱中培养24 h后取出小室，4%多聚甲醛溶液固定细胞，0.1%的结晶紫溶液染色30 min，棉签擦去上室内的细胞，PBS 清洗3 次，倒置晾干，高倍显微镜下随机选取5 个高倍视野进行细胞观察计数，取平均值。

1.5 细胞迁移能力检测 采用划痕实验。收集转染 后 24 h 的 miR-138 mimics 组 和 NC-mimics 组MHCC97H 细胞，以2×105个/孔的细胞密度接种于6孔细胞板中，在37 ℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长满至90%后，用200µL 微量移液枪头在细胞板上垂直进行“一”字划痕，PBS 冲洗细胞2 次去除脱落的细胞，继续培养24 h 后在倒置显微镜下观察细胞的划痕愈合情况，计算划痕愈合率（%）。

1.6 E-cadherin、Vimentin 蛋白检测 采用Western blotting 法。取转染后 24 h 的 miR-138 mimics 组和NC-mimics 组MHCC97H 细胞，抽取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白样品的浓度。每个样本取得20µg总蛋白上样，进行10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳分离，电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，PVDF膜以5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育过夜，分别加入E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、β-action（1∶2 000）一抗，次日TBST 洗膜后，加入二抗后37 ℃孵育 1 h，TBST 洗膜后，ECL 显影。应用Quality One 分析条带灰度值，以β-action作为内参照，计算E-cadherin、Vimentin 蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析或独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 组织及癌旁组织中miR-138 表达比较HCC 组织及癌旁组织中miR-138的相对表达量分别为0.41±0.09、1.08±0.06，两者相比P<0.05。

2.2 HCC 组织中miR-138 的表达与患者临床病理特征的关系 以60 例HCC 组织中miR-138 表达的均值为截断值，将60 例HCC 患者分为miR-138 高表达27 例和miR-138 低表达33 例。进一步统计分析显示，miR-138 的表达与HCC 患者的微血管侵犯、TNM 分期密切相关（P 均<0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤直径、Edmondson 分级、AFP 水平、HBV 感染等临床病理特征无关，见表1。

表1 HCC组织中miR-138的表达与患者临床病理特征的关系（例）

2.3 HCC 细胞与正常肝细胞中miR-138 表达比较 HCC 细胞系 MHCC97H、MHCC97L 和 HepG2 中miR-138 的相对表达量分别为 0.26 ± 0.12、0.58 ±0.10、0.62 ± 0.11，均低于正常人肝细胞系 L02 中miR-138的相对表达量（1.02±0.04），P均<0.05，且MHCC97H 细胞中miR-138 的相对表达量低于MHCC97L 细胞和 HepG2 细胞（P均<0.05）。选择miR-138 表达最低的MHCC97H 细胞作为后续实验研究对象。

2.4 miR-138 对MHCC97H 细胞侵袭能力的影响miR-138 mimics 组、NC-mimics 组细胞划痕愈合率分别为（86± 18）、（180± 21）个，两组相比P<0.01。

2.5 miR-138 对MHCC97H 细胞迁移能力的影响miR-138 mimics 组、NC-mimics 组细胞中 miR-138的相对表达量分别为 1.01 ± 0.03、4.89 ± 0.27，两组相比P<0.05。miR-138 mimics 组、NC-mimics 组细胞划痕愈合率分别为（21.4 ± 2.6）%、（65.8 ±4.6）%，两组相比P<0.01。

2.6 miR-138 对 MHCC97H 细 胞 EMT 的 影 响miR-138 mimics 组 MHCC97H 细 胞 E-cadherin 蛋 白表达高于NC-mimics 组（P<0.05），Vimentin 蛋白表达低于NC-mimics组（P<0.05），见表2。

表2 两组MHCC97H细胞EMT相关蛋白表达比较（±s）

表2 两组MHCC97H细胞EMT相关蛋白表达比较（±s）

组别NC-mimics组miR-138 mimic组t P E-cadherin蛋白表达0.22±0.08 1.39±0.19 9.830 0.001 Vimentin蛋白表达1.89±0.23 0.79±0.15 6.939 0.002

3 讨论

手术切除是目前治疗HCC 的首选方案，但患者术后常较早出现复发、转移，导致HCC 患者预后较差。HCC 复发转移的分子生物学机制尚未明确，尚缺乏有效的治疗手段。近年来，随着基因组学和蛋白组学的发展，恶性肿瘤侵袭进展的分子生物学机制逐渐被发现，为阻断恶性肿瘤的复发转移提供了新的方向。

miRNA 是一类非编码小分子RNA，长度21～24个碱基，通过调控下游靶基因的翻译，在人体生命活动中起着极其重要的作用。近年来，越来越多的相关研究显示miRNA 在恶性肿瘤的发生进展、微环境改变、侵袭转移等方面发挥着重要的调控作用［5］。随着研究的深入，在HCC 发生发展过程中也发现了许多起着重要调控作用的 miRNA。SUN 等［6］发现HCC 组织中miR-5692a 高表达，并且与临床分期、远处转移及不良预后密切相关。WANG 等［7］报道，上调miR-200b 能明显抑制HCC 细胞的生长和转移。miR-212［8］、miR-539［9］、miR-371［10］等 miRNA 相继被发现与HCC 发生进展、侵袭转移有关。但至今尚未发现在HCC 发生进展过程中起着关键作用的miR⁃NA。miR-138 是新近发现的miRNA 家族重要成员之一，研究发现 miR-138 在口腔鳞癌［11］、胆囊癌［12］、肾细胞癌［13］、非小细胞肺癌［14］等恶性肿瘤中异常低表达，扮演着“抑癌基因”的角色。目前有关miR-138 在HCC 中的研究甚少。本研究发现，HCC 组织中miR-138的表达低于癌旁组织，并且miR-138的表达与HCC 患者的微血管侵犯、TNM 分期关系密切。进一步研究发现，HCC 细胞中miR-138 的表达低于正常肝细胞，并且高侵袭性MHCC97H 细胞中miR-138 的表达低于低侵袭性的MHCC97L 细胞和HepG2 细胞，提示 miR-138 可能参与了 HCC 的发生发展，可能与HCC的侵袭转移有关。

为了进一步明确miR-138是否与HCC的侵袭转移有关，本研究在体外实验中选择高侵袭性MHCC97H 细胞做为后续研究对象，通过脂质体转染的方法，转染miR-138 mimics至MHCC97H细胞成功上调其miR-138 的表达，划痕实验和Transwell 侵袭实验显示，转染后MHCC97H 细胞划痕愈合率和穿膜细胞数明显下降，提示上调miR-138 能够明显抑制MHCC97H 细胞的迁移和侵袭能力。EMT 是肿瘤细胞侵袭迁移的重要启动环节［15-16］。EMT 发生时，上皮细胞源性标志物E-cadherin 表达会显著降低，而间质细胞源性标志物Vimentin 表达会显著增加［17］。本研究发现，上调miR-138的MHCC97H细胞E-cadherin 蛋白表达升高，而Vimentin 蛋白表达降低，提示上调miR-138能够明显抑制MHCC97H细胞的EMT，从而对细胞的迁移和侵袭能力起明显的抑制作用。

综上所述，miR-138在HCC 中表达降低，并且与HCC 细胞的侵袭能力有关；上调miR-138 能够抑制HCC细胞的EMT及侵袭迁移能力，这为HCC的治疗提供了新的研究方向。