张茂华 罗金键 王康康 汪秀梅 吴慧丽

郑州大学附属郑州中心医院消化内科（郑州450007）

肝硬化是临床常见慢性肝病，是多种原因引起的肝脏进行性、弥漫性、纤维性病变，我国肝硬化病因以乙型病毒性肝炎为主，是乙型肝炎病毒（HBV）持续感染，导致肝小叶结构破坏和纤维化的结果［1］。临床常采用外科手术、抗病毒等手段治疗乙肝肝硬化，但远期生存率仍较低［2］。研究［3］表明，乙肝肝硬化主要是由病毒诱发的机体免疫反应所致，HBV感染期间，T淋巴细胞可通过肿瘤坏死因子⁃α/核因子⁃κB（TNF⁃α/NF⁃κB）信号通路被激活，起到抑制或清除病毒的作用。CD40 及其配体（CD40L）分别表达于抗原递呈细胞和活化T 细胞表面，两者相互作用为T 细胞活化提供必要的协同刺激信号，促进机体免疫反应［4］。近年来研究［5-6］发现，CD40 基因位点多态性与甲状腺功能亢进、糖尿病等自身免疫性疾病发病关系密切，但关于CD40 遗传位点多态性与乙肝肝硬化发病及预后报道尚少。为明确CD40基因位点多态性在乙肝肝硬化中的作用，本研究选取480例乙肝肝硬化患者，分析CD40基因多态性与遗传易感性和预后生存的关系，为乙肝肝硬化的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年2月至2018年1月本院收治的480 例乙肝肝硬化患者，其中男336 例，女144例；年龄43 ～73岁，平均（54.20±9.44）岁，乙肝病毒感染病程8 ～33年，平均（15.51 ± 6.02）年；基础疾病：高血压46 例，糖尿病35 例，高脂血症42 例；所有患者均接受保肝、抗纤维化、纠正肝功能等对症内科综合治疗。纳入标准：（1）符合肝硬化诊断标准，且经腹部影像学或肝脏病理学检查证实；（2）符合《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准［7］；（3）乙肝表面抗原（HBsAg）阳性时间6 个月以上，且PCR 法检测两次HBV DNA 含量> 1 000 copies/mL；排除标准：（1）合并艾滋病病毒感染、其他类型肝炎病毒感染者；（2）合并原发性肝癌、肝衰竭或其他病因所致的肝硬化者；（3）合并自身免疫性疾病如多发性硬化、甲状腺功能亢进等。

选取门诊收治的乙肝肝硬化患者480 例为乙肝组，其中男359 例，女121 例；年龄40 ～74 岁，平均（55.26 ± 9.13）岁，乙肝病毒感染病程8 ～25年，平均（11.63 ± 6.48）年；基础疾病：高血压42 例，糖尿病31 例，高脂血症40 例。

此外，选取同期体检中心收入的健康受试者480 例为健康组，其中男342 例，女138 例；年龄45 ～75 岁，平均（55.87±9.12）岁，既往接种乙肝疫苗或体内有乙肝病毒相关抗体。所有受试者均签署知情同意书，本研究获得医院伦理委员会审批。

1.2 基因多态性检测采集所有受试者外周血2 mL，静置分层，加入抗凝管，细胞裂解液孵育后，2 500 r/min 离心15 min（离心半径10 cm），取沉淀，采用酚氯仿法抽提DNA，然后采用聚合酶链反应⁃限制性片段长度多态性（PCR⁃RFLP）法检测目的基因多态性：采用PCR 扩增试剂盒（日本TaKaRa公司）说明书扩增目的片段，引物序列CD40⁃rs1883832：F：5′⁃ATGCTGATGCTGGTAGCA⁃3′，R：5′⁃CCATGCTGATGCTGATGT⁃3′；CD40⁃rs4810485：F：5′⁃ACGTGATGCTGGCTACGAC⁃3′，R：5′⁃CGAT⁃GCTGATGCTGATGCA⁃3′。反应条件为95 ℃预变性3 min；（95 ℃变性60 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s）40 个循环，72 ℃再延伸5 min，获得PCR 产物。设定RELP 反应体系：PCR 产物5.0 μL，Buffer 缓冲液1.0 μL，限制性内切酶1.0 μL（NCOⅠ、MSPL），ddH2O 8.0 μL，37 ℃水浴酶切，酶切产物进行30 g琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照鉴定，采用双盲法进行基因型判读（CD40⁃rs1883832：长度为332 bp条带为CC 基因型，长度为332、272、105 bp 条带为CT 基因型，长度227、105 bp 条带为TT 基因型；CD40⁃rs4810485：长度为435 bp 条带为CC 基因型，长度为435、272、163 bp 条带为CG 基因型，长度272、163 bp 条带为GG 基因型），由2 人分别进行判读，对结果不一致的样本重新检测，基因分型成功率100%。

1.3 临床资料收集及随访收集受试者临床资料，包括性别、年龄、体质量指数（BMI=体质量/升高2）、吸烟史（吸烟> 5 支/d，烟龄> 5年）、饮酒史（饮酒量> 40 g/d，酒龄> 5年）、乙肝病毒感染病程（>10年，≤10年）、有无抗病毒治疗、肝功能Child⁃Turcotte⁃Pugh（CTP）分级、肝硬化分期［代偿期（Child⁃Pugh A 级），失代偿期（Child⁃Pugh BC级）］、并发症（门静脉高压、上消化道出血、肝性脑病、肝肾综合征、肝肺综合征、原发性肝癌等）、CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485 基因型及实验室指标：HBV DNA 含量、丙氨酸氨基转移酶水平、凝血酶原活动度。以查询病例档案或电话方式随访，明确乙肝肝硬化患者生存情况，每3 个月至少随访1 次，随访时间为2015年2月至2020年1月，终点事件为乙肝肝硬化导致的死亡。

1.4 统计学方法采用SHEsis软件对健康组CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485位点多态性分布频率进行Hardy⁃Weinberg 平衡分析。采用SPSS 22.0 分析处理数据，计数资料以例数或百分比表示，两样本计数资料比较采用χ2检验，等级计数资料采用秩和检验；计量资料以均数±标准差表示，两样本比较采用独立样本t检验；应用Kaplan⁃Meier 法分析不同基因型患者预后生存情况，并进行Log⁃rank 检验，并采用Cox 回归分析模型分析CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485 基因型与乙肝肝硬化预后生存情况。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组临床资料比较病例组、乙肝组及健康组性别构成、年龄、BMI、吸烟史患者占比比较，差异均无统计学意义（P> 0.05）；病例组饮酒史患者占比高于乙肝组和健康组，乙肝组饮酒史患者占比、乙肝病毒感染病程高于健康组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 三组临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data between two groups例（%）

2.2 Hardy⁃Weinberg 遗传平衡检验经Hardy⁃Weinberg 遗传平衡检验，健康组CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485 位点基因型频率实际值与理论值见比较差异均无统计学意义（P>0.05），符合Hardy⁃Weinberg 遗传平衡规律，本研究所选样本具有群体代表性。

2.3 三组CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485 基因多态性比较健康组、乙肝组和病例组CD40⁃rs1883832 基因型等级分布及等位基因频率比较，差异均有统计学意义（P< 0.05），且病例组CD40⁃rs1883832 T 等位基因频率高于健康组和乙肝组，且乙肝组高于健康组，差异均有统计学意义（P>0.05）。健康组、乙肝组和病例组CD40⁃rs4810485基因型等级分布及等位基因频率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.4 CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485 基因多态性对乙肝肝硬化预后的影响以性别（女= 0，男= 1）、年龄（< 60 岁= 0，≥60 岁= 1）、饮酒史（无= 0，有= 1）、吸烟史（无= 0，有= 1）、乙肝病毒感染病程（≤10年= 0，> 10年= 1），抗病毒治疗（有= 0，无= 1）、肝硬化分期（代偿期= 0，失代偿期=1）、并发症（无=0，有=1）、HBV DNA 含量（< 104 copies/mL = 0，≥104 copies/mL = 1）、ALT（< 5 倍正常值= 0、≥5 倍正常值= 1）、凝血酶原活动度（> 75% = 0，≤75% = 1）、BMI（以18.5 ～23.9 kg/m2为对照进行哑变量化）、CTP 分级（以A级为对照进行哑变量化）为调整变量，分别以CD40⁃rs1883832 基因型（以CC 基因型为对照进行哑变量化）、CD40⁃rs4810485 基因型（以CC 基因型为对照进行哑变量化）为自变量分别建模进行Cox 回归分析。

Cox 回归分析结果显示，CD40⁃rs1883832 位点CT、TT 基因型是影响乙肝肝硬化预后的独立危险因素（HR=1.682、2.588，P<0.05）。见表3。

表2 3 组CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485 基因多态性比较Tab.2 Comparison of gene polymorphism of CD40⁃rs1883832 and CD40⁃rs4810485 in three groups

表3 Cox 回归分析结果Tab.3 Cox regression analysis

2.5 CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485 基因多态性与乙肝肝硬化总生存关系分析病例组研究对象随访时间24 ～60个月，失访45例，失访率9.38%，2年病死率16.55%（72/145）。CD40⁃rs1883832 基因野生C 等位基因（CC + CT）患者327 例失访24 例，2年死亡33 例；非携带C 等位基因（TT）患者153 例失访21 例，2年死亡39 例；经Kaplan⁃Meier生存曲线分析，CD40⁃rs1883832（CC + CT）基因型与TT 基因型患者生存曲线比较，差异有统计学意义（χ2= 7.831，P= 0.008）。CD40⁃rs4810485 基因野生C 等位基因（CC + CG）患者375 例失访33 例，2年死亡51 例；非携带C 等位基因（GG）患者105例，失访12 例，死亡21 例；携带CD40⁃rs4810485（CC + CG）基因型与（GG）基因型患者生存曲线比较，差异无统计学意义（χ2=1.128，P=0.301）。随访情况见表4，生存曲线见图1、2。

3 讨论

我国是HBV 病毒感染高度流行区，部分患者成年后可清除病毒，但仍有部分患者发展为慢性HBV 感染，最终导致肝硬化发生，乙肝肝硬化患者常因肝功能衰竭、出血倾向、肝癌而危及生命［8-10］。既往研究表明［11-12］，健康人血清中可溶性CD40（sCD40）表达水平较低，在HBV 相关肝病患者研究中发现，CD40 表达强度与炎症程度正相关，高水平CD40 可增强T 细胞亚群分化从而增强机体抗病毒能力，但同时也导致肝脏免疫损害，干细胞凋亡指数升高，但具体作用机制不明。研究显示［13］，机体遗传背景的差异很大程度上决定宿主对免疫反应的差异，而CD40 基因多态性可增加多种自身免疫性疾病的易感性，探讨CD40 基因多态性与乙肝肝硬化发病和预后的关系有重要临床意义。

表4 不同基因型乙肝肝硬化患者随访情况Tab.4 Follow up of hepatitis B cirrhosis patients with different genotypes

图1 CD40⁃rs1883832 不同基因型乙肝肝硬化患者生存曲线Fig.1 Survival curve of hepatitis B cirrhosis patients with different CD40⁃rs1883832 genotypes

图2 CD40⁃rs4810485 不同基因型乙肝肝硬化患者生存曲线Fig.2 Survival curve of hepatitis B cirrhosis patients with different CD40 genotypes

CD40 及其配体分别属于Ⅰ、Ⅱ型跨膜蛋白，是TNF⁃α受体及TNF⁃α家族成员，CD40/CD40L 作为免疫协同分子，在免疫炎症反应过程中发挥双重调节作用［14］。一方面，CD40/CD40L可通过促进促炎因子分泌增强细胞毒T 细胞活性，促进辅助性T细胞1（Th1）免疫炎症反应；另一方面可激活巨噬细胞分泌抗炎因子抑制Th1 免疫炎症反应［15-16］。HBV 感染后临床转归与宿主免疫状况关系密切，基因多态性是决定素组对疾病易感性与抵抗力的重要因素。既往报道表明，CD40⁃rs1883832 基因多态性可通过影响CD40 表达水平，诱导T 淋巴细胞向Th2 型细胞分化偏移，参与Graves′眼病免疫病理进程，增强对疾病的易感性［17］。

目前关于CD40基因多态性与乙肝肝硬化易感性研究尚少，本研究选取CD40⁃rs1883832、CD40⁃rs4810485多态性位点发现，病例组CD40⁃rs1883832 T 等位基因频率高于健康组和乙肝组，3 组CD40⁃rs4810485 等位基因频率无明显差异，提示CD40⁃rs1883832 T 基因型携带者与乙肝肝硬化遗传易感性关系密切，而乙肝组T等位基因频率高于健康组，推测乙肝病毒感染可能会增加CD40⁃rs1883832 突变风险，从而增加肝硬化发病风险。分析可能机制为CD40⁃rs1883832 T 基因型携带者影响CD40 表达水平，导致细胞毒T 细胞对HBV 感染的反应强度增强，肝脏长期免疫损害终致肝硬化发生；另一方面，非T 基因型携带者（CC 基因型）可能通过促进Th1 向Th2 免疫漂移，抑制细胞毒T 细胞激活，从而是肝脏逃避免疫损害，仅表现为长期携带，肝硬化发生风险较低［18］。

此外，本研究经Kaplan⁃Meier 生存曲线分析，CD40⁃rs1883832 CC + CT 基因型患者与TT 基因型患者2年生存曲线比较有明显差异，进一步Cox 回归分析，CT、TT 基因型是影响乙肝肝硬化预后的独立危险因素，提示与CD40⁃rs1883832 CC+CT 基因型相比，TT 基因型乙肝肝硬化患者预后不良风险更高。研究［19］证实，CD40 表达缺失可增加T 细胞自身反应性，从而导致自身免疫性疾病。CD40⁃rs1883832 TT 基因型乙肝肝硬化患者可能通过影响CD40 表达水平，使HBV 病毒持续激活抗病毒免疫反应，导致肝脏细胞持续受损，使急性失代偿性肝硬化发生风险增加，进而导致预后生存期缩短。

综上所述，CD40⁃rs1883832 基因多态性与乙肝肝硬化遗传易感性及预后关系密切，且与CD40⁃rs1883832 CC+CT 基因型相比，TT 基因型乙肝肝硬化患者预后不良风险更高。但乙肝肝硬化临床结局由综合因素共同决定，遗传背景因素也十分复杂，常由多基因多位点共同参与调控，本研究初步探索CD40 基因多态性与与乙肝肝硬化遗传易感性及预后关系，为乙肝肝硬化疾病防治提供理论基础。