蒋 畅，阚永军，赵 立，肖 庆，韩 静*，胡 娟

(1.福建省中医药科学院，福建 福州 350003；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003)

由新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的肺炎疫情(COVID-19)自2019年末暴发，肆虐至今，截至目前全球已有上百万人被感染[1]。新冠肺炎是继SARS、MERS后，由冠状病毒引发的又一新型大范围流行病，对公共安全造成了极大威胁。新冠肺炎患者前期出现乏力、干咳、胃肠道不适等症状，后期病情加剧，可出现呼吸窘迫综合征并引发脓毒性休克，严重危及患者生命[2-4]。寻找到针对新型冠状病毒的特效药物，抑制新冠肺炎的全球蔓延趋势，是当前科研工作的重中之重。

在应对病原体尚未明确的新型突发性传染病时，传统中医可在辨证论治的理论体系指导下进行有效诊疗，具有独特优势[5]。中医学将此类病毒导致的传染性疾病归于“温病”范畴，在数千年的历史实践中积累了大量治疗此类疾病的相关经验，《金匮要略》《黄帝内经》等中医经典中亦收录了大量相关处方[6-8]。在当前紧迫的抗疫局势下，从疗效确切的中医药相关处方中寻找有效防治新冠肺炎的药物刻不容缓。

国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中明确指出，新冠肺炎病在寒湿[9]。根据“风能胜湿”理论，常用药对荆芥-防风广泛应用于中医温病经方[10]，《本草求真》云：“用防风必兼荆芥者，以其能入肌肤宣散故耳。”《施今墨对药临床经验集》云：“若属外感证，用麻桂嫌热、嫌猛；用银翘嫌寒时，荆防用之最宜。”荆芥味辛，性温，入肺、肝经；防风味辛、甘，性微温，入膀胱、肝、脾经[11]，二者合用十分切合新冠肺炎的中医病机，可能对防治新冠肺炎具有积极作用。

网络药理学分析注重系统性、综合性、整体协调性，与中草药多成分靶标、多途径协同作用的特点具有相似性[12]。本研究采用网络药理学方法筛选荆芥-防风药对防治新冠肺炎可能的作用靶标，并通过分子对接进行药物-靶标结合位点分析，探讨其防治新型冠状病毒肺炎的可能作用机制，为寻找新冠肺炎防治药物提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 活性成分与相关靶标的收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(http：//tcmspw.com/index.php)对荆芥(SchizonepetaeHerba)、防风(SaposhnikoviaeRadix)的化学成分进行检索，根据药物动力学参数ADME，以生物利用率OB≥30%及类药性DL≥0.18为标准进行进一步筛选，获得荆芥-防风药对的活性成分及其对应的靶标信息。利用UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)获取各靶标蛋白所对应的人类基因名，对靶标蛋白进一步标准化，建立数据集。

1.2 新冠肺炎靶标的收集

利用GenCards数据库(https：//www.genecards.org/)，以“COVID-19”为关键词，限定物种为“Homo Sapiens”，检索并收集与新冠肺炎相关的基因靶标。

1.3 荆芥-防风药对防治新冠肺炎的作用靶标预测

通过Venny(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将药物预测靶标与新冠肺炎靶标进行映射，获得荆芥-防风药对防治新冠肺炎的潜在作用靶标并进行可视化分析。

1.4 基因富集分析

利用STRING数据库(https：//string-db.org/)对“1.3”项中所收集的共同靶标进行GO(Gene Ontology)富集分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析，通过OmicShare(https：//www.omicshare.com/tools/)对结果进行可视化处理。

1.5 成分-靶标-通路网络的构建

通过Cytoscape软件，将“1.1”项中所收集的药物活性成分、“1.3”项中所收集的共同靶标及“1.4”项中所得到的作用通路构建为“成分-靶标-通路”网络并进行可视化，通过网络分析获得核心靶标及关键核心成分。

1.6 成分-靶标分子对接

通过PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找荆芥-防风药对关键活性成分与部分现阶段临床报道有效药物的2D结构，通过Chem 3D软件优化力学结构后保存，作为配体；通过PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)查找SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB id：6M2Q)及ACE2(PDB id：1R42)的蛋白质3D结构，通过PyMol软件删除水分子及蛋白结构中的小分子配体后，加氢保存，作为受体；利用CB-Dock(http：//cao.labshare.cn/cb-dock/)进行分子对接。

2 结果

2.1 活性化合物与相关靶标筛选结果

中药多为口服给药，其体内过程包括吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)、排泄(Excretion)，药物的ADME属性对预测药物的生物活性及利用率有着重要意义。在TCMSP数据库中，以口服生物利用率OB≥30%，类药性DL≥0.18为筛选条件，筛查得到荆芥与防风的活性化合物分别为11个、18个，其中活性成分MOL000358、MOL000359为二者共有，删除重复项后共获得荆芥-防风药对活性化合物27个，涉及212个靶标(见表1、表2)。

续表1

表2 荆芥-防风药对活性化合物作用靶标

2.2 荆芥-防风药对防治新冠肺炎的潜在作用靶标

将212个荆芥-防风药对作用靶标与从GenCards数据库中收集的350个新冠肺炎作用靶标进行映射，取交集共得到47个交叉靶标，即荆芥-防风药对防治新冠肺炎的潜在作用靶标，见图1。

图1 荆芥-防风药对与新冠肺炎靶标Venn图

2.3 GO富集分析结果

将47个荆芥-防风药对防治新冠肺炎的潜在作用靶标导入STRING数据库，从生物学过程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和细胞组分(Cellular component，CC)三个部分进行富集分析，可知荆芥-防风药对参与了细胞因子介导的信号通路、炎症反应、细胞凋亡以及蛋白受体结合等相关生物学过程，结果见表3、表4、表5。

表3 GO富集分析(BP)Top30

表4 GO富集分析(CC)Top20

表5 GO富集分析(MF)Top30

2.4 KEGG富集分析结果

通过STRING数据库对47个荆芥-防风药对防治新冠肺炎的潜在作用靶标进行KEGG信号通路富集分析，以FDR值与基因相关数进行排序，取前20条为显著相关通路，涉及IL、NF-κB信号通路以及甲型流感、疱疹病毒感染、结核等多条感染相关通路，结果见图2。

图2 KEGG富集结果(Top20)

2.5 成分-靶标-通路网络

利用Cytoscape软件处理“1.1”项中所收集的药物活性成分、“1.3”项中所收集的共同靶标及“1.4”项中所得到的作用通路，构建为“成分-靶标-通路”网络并进行可视化处理，结果见图3。该网络共有90个节点，430条边。蓝色矩形各点代表荆芥-防风药对中的有效化合物，黄色圆圈与红色圆圈中各个点分别代表不同的作用靶标和通路。网络拓扑学分析结果表示，该网络节点的平均度值为9.56，大于平均度值的节点共43个，平均中介中心度为18.02，大于平均中介中心度的节点有33个，以网络拓扑学核心特征节点度值、中介中心度均大于平均值为条件进行筛选显示，槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、β-谷固醇等有效化合物及IL-6、TP53、CASP3、IL10、MAPK1、CXCL8、CCL2、IL1B、MAPK14、RELA、PTGS2、IL4、FOS等作用靶标在荆芥-防风药对的化合物-作用靶标-通路网络中具有重要作用，涉及多条病毒性感染、免疫调控、炎症通路，这可能是荆芥-防风药对发挥新冠肺炎防治效果的核心化合物、作用靶标以及通路。

图3 成分-靶标-通路网络

2.6 分子对接结果分析

将荆芥-防风药对中排序前4位的核心活性化合物及部分现阶段临床报道有效的药物(氯喹、瑞德西韦、利托那韦、洛匹那韦)通过CB-Dock与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2进行分子对接，预测药物与蛋白靶标之间的相互作用模式。结果显示，荆芥-防风药对中的核心活性化合物与ACE2及2019-nCoV水解酶对接Vina得分均小于-6，且最优结合位点大多与现阶段临床报道有效药物结合位点一致，提示核心活性化合物与蛋白靶标之间发生相互作用的可能性较大(见表6)，核心活性化合物与蛋白靶标结合示意图见图4、图5。

表6 药物-靶标分子对接汇总

图4 荆芥-防风药对核心化合物与ACE2分子对接

图5 荆芥-防风药对核心化合物与2019-nCoV3CL水解酶分子对接

3 讨论

新冠肺炎属于中医学“温病”范畴，以寒湿邪毒为主要病因病机，患者前期主诉食少便溏而非发热。荆芥-防风为临床常用辛温解表药对，荆芥祛风解表、宣毒透疹、理血止痉；防风祛风解表、疏肝解痉、杀虫止痒。现代药理学研究证实二者均可解热镇痛、抗菌消炎、增强免疫功能，具有相似的药理作用[13-15]。可见，新冠肺炎的发病特点、临床症状、中医证候与荆芥-防风药对的临床应用相符，该药对具有防治新冠肺炎的可能性。

在本研究中，药物成分-基因靶标-疾病网络共有90个节点、430个连接，在一定程度上反映了药物与靶标之间相互作用的复杂性。通过GO富集分析发现，荆芥-防风药对防治新冠肺炎的可能生物过程涉及细胞反应、信号传导、免疫调节、细胞凋亡等；细胞组成涉及膜筏、转录因子复合体、受体因子复合体等；分子功能涉及蛋白受体结合、激酶活化、转录因子结合等。KEGG通路富集分析发现，荆芥-防风药对涉及疱疹病毒感染、利什曼病、查加斯病、乙型肝炎、结核、百日咳、甲型流感等多条病毒感染通路，其防治新冠肺炎的可能机制与TNF信号通路、NF-κB信号通路介导细胞炎性因子IL-17有较为紧密的联系。

2019-nCoV与SARS-CoV的感染途径相同，均通过病毒表面S蛋白与宿主细胞ACE2结合入侵[16]。药物作用于ACE2特异性位点可阻断病毒S蛋白与之结合，达到防治目的。2019-nCoV 3CL水解酶负责水解多聚蛋白，使之具有复制及转录功能，是新冠病毒复制过程中的重要一环[17]。分子对接结果显示荆芥-防风药对核心活性化合物对ACE2和2019-nCoV 3CL水解酶均具有较好的结合性，且最优结合位点大多与现阶段临床报道的有效药物的结合位点一致。该结果进一步证明了荆芥-防风药对作用于新冠肺炎关键靶标蛋白的可能性以及网络药理学分析预测的可靠性。

综上所述，荆芥-防风药对可能通过多种活性化合物调控细胞因子，参与炎性反应及免疫应答过程，介导多条炎症、感染相关信号通路，发挥防治新冠肺炎的作用。这一独特的作用机制体现出了中药治疗疾病多成分靶标、多途径协同作用的特点。本研究通过网络药理学方法结合分子对接技术对荆芥-防风药对防治新型冠状病毒肺炎的潜在物质基础与作用机制进行了初步探究，为后续相关制剂开发研究奠定了基础。

目前大多数分子对接工具都需要在用户预先设定对接位置坐标的基础上进行拟合[18]，本次研究所采用的CB-Dock可通过perl脚本自动计算空腔中心并应用于AutoDock Vina计算[19]，结果更为精准可信。但需要注意的是，受限于目前计算机拟合方法本身的局限性，分子对接计算结果可能与实际临床疗效不尽相同，只有立足于临床药效观察情况，开展相关实验研究对计算结果进行验证，方能去伪存真，为中药防治新冠肺炎提供更加充分有力的证据。