朱滨， 张前燕， 华贤章， 骆渊城， 敖传西， 刘林

（1.湖北省恩施土家族苗族自治州民族医院骨伤科，湖北恩施 445000；2.湖北省恩施土家族苗族自治州民族医院急诊科，湖北恩施 445000；3.湖北民族大学附属民大医院骨科，湖北恩施 445000）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种老年群体容易罹患的慢性退行性关节疾病，其发病率随着年龄的增长而升高，其临床病理表现为关节软骨缺损及软骨下骨质增生[1]。目前，OA 的发病机制尚不完全清楚，但氧化应激、炎症因子、维生素D、肥胖等因素都可能导致OA 的发生[2]，其中，炎症因子诱导的软骨细胞外基质（ECM）的过度降解和软骨退化被认为是OA 发生的主要原因[3]。甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根与根茎。味甘，性平，无毒。《本经》记载，甘草可除五脏六腑寒热邪气，坚筋骨，长肌肉，倍气力，金疮尰，解毒，久服轻身延年。《别录》记载，甘草温中下气，止渴，通经脉，利血气。甘草甜素是从甘草中提取的一种主要活性成分，具有高甜度、低热量、安全无毒等优点[4]，还有很好的抗炎[5]、抗氧化活性[6]及保护神经功能[6]的功效。本次研究旨在探讨甘草甜素对OA 大鼠模型的治疗作用及机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1动物SPF 级雄性4 周龄SD 大鼠30 只，体质量264～282 g，购自北京阜康生物科技股份有限公司[许可证号:SCXK（京）2014-0009]。所有大鼠均饲养在中国医学科学院医学实验动物研究所屏障环境动物房[许可证号:SYXK（京）2015-0035]，全天自由饮水。

1.2药物、试剂与仪器甘草甜素（中国食品药品检定研究院，批号:160904），纯度为99.9%，化学结构式见图1。兔抗Caspase-3、Caspase-9、基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-13、CollagenⅡ、Aggrecan、转化生长因子（TGF）-β、Smad1、磷酸化Smad1（p-Smad1）、β-actin 多克隆抗体（美国Abcam 公司）；异硫氰酸荧光素（FITC）标记CD4 单克隆抗体（美国BD Pharmingen 公司）；藻红蛋白标记的白细胞介素17（IL-17）、Foxp3 单克隆抗体，别藻蓝蛋白标记的CD25 单克隆抗体（美国eBioscience 公司）；Fixation/Permeabilisation 试剂盒（美国eBioscience 公司）；总RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（qRTPCR）试剂盒[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter 公司）；正置荧光显微镜（美国Thermo 公司）；实时荧光定量PCR 仪（瑞士罗氏公司）；流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司）；VU-1206 紫外分光光度计（日本Shimodzu公司）。

图1 甘草甜素的结构式Figure 1 Structural formula of glycyrrhizin

1.3分组、动物模型制备[7]与给药将30 只大鼠随机分为假手术组（6只）和OA造模组（24只）。造模组大鼠腹腔注射100 g/L 水合氯醛（3 mL/kg）进行麻醉，在手术及周围区域进行备皮，用湿纱布清洗后碘伏消毒，选择靠近右膝关节内侧处将皮肤和关节腔切开，将髌骨后翻，保持膝关节处于最大屈曲状态；暴露关节腔，利用显微器械切断膝前交叉韧带，避免损伤软骨，切断后通过抽屉实验确认前交叉韧带是否被切断。以右肢踝骨处出现歪曲和颤动，表示造模成功。假手术组大鼠只剪开皮肤和关节腔。所有操作完成后用生理盐水冲洗关节，对关节囊和皮肤处进行缝合，碘伏棉球擦洗伤口后贴上敷贴，然后将大鼠放于笼中，使之自由活动，密切关注伤口感染及其他并发症情况。24 只大鼠共制备成功22 只，将造模成功大鼠随机分为模型组（6只）、甘草甜素低剂量组（5 只）、甘草甜素高剂量组（5 只）、来氟米特组（6 只）。甘草甜素低、高剂量组分别给予腹腔注射25、50 mg/kg甘草甜素，来氟米特组给予灌胃1.87 mg/kg 来氟米特混悬液，模型组与假手术组大鼠腹腔注射同等体积的生理盐水。每天1 次，连续给药3周。

1.4观察指标与方法

1.4.1 番红O 染色 将各组大鼠麻醉后置于冰盒上取膝关节内侧胫骨平台后1/2 处，用手术刀剪成0.5 cm × 0.2 cm × 0.5 cm 的小骨块，漂洗后40 g/L多聚甲醛固定24 h。流水冲洗1 h 后在100 g/L 乙二胺四乙酸钠（EDTA）脱钙液中脱钙2 个月，脱钙完成后进行常规标本脱水，浸蜡，石蜡包埋，连续切片5 μm 厚。二甲苯脱蜡后用无水乙醇和95%乙醇分别浸泡3 min，蒸馏水冲洗3 min，苏木精染色5 min，流水冲洗3 min 后，快绿染色7 min，0.1%番红O 染色8 min，95%乙醇浸洗3 min，无水乙醇浸洗2 次（3 min/次），二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜下观察软骨退化情况。

1.4.2 qRT-PCR 检测 按照总RNA 提取试剂盒说明书上的操作步骤提取各组大鼠软骨组织中的总RNA，应用紫外分光光度计检测其吸光度（OD）值判定RNA的纯度（OD260nm/OD280nm为1.8～2.0），并用凝胶电泳检测RNA的完整性。按照反转录试剂盒说明书进行cDNA 的合成。反转录体系（10 μL）:2×miRNA 反 应 混 合 液5 μL，0.1% BSA 1 μL，miRNA PrimeScript®RT 酶 混 合 物1 μL，总RNA 0.5 μL，去RNA 酶ddH2O 2.5 μL。反应条件设置:37 ℃60 min，85 ℃5 s，4 ℃30 min。PCR 体系10 μL:SYBR®Prmix Ex TapⅡ（2×）5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR 反应参数设置:50 ℃5 min；95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，40 个循环。Caspase-3 上游引物序列为5’-CAGACAGTGGAA CTGACGAT-3’，下游引物序列为5’-TTTCAGCA TGGCGCAAAGTG-3’，扩增片段长度564 bp；Caspase-9 上游引物序列为5’-TTTTCTCCCAAAAG CCTTCA-3’，下游引物序列为5’-AGTCTGCAGC TCCTCCACAT-3’，扩增片段长度482 bp；内参基因β-actin 上游引物序列为5’-AGCCATGTACGTA GCCATCC-3’，下游引物序列为5’-GTGGTGGTG AAGCTGTAGC-3’，扩增片段长度210 bp。用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.4.3 蛋白免疫印迹法检测 提取各组大鼠软骨组织中的总蛋白，采用Bradford 法调整各组蛋白浓度一致。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白并将蛋白转至甲醛预处理过的聚偏氟乙烯（PVDF）膜，密封2 h；分别加入Caspase- 3、 Caspase- 9、 MMP- 1、 MMP- 13、CollagenⅡ、Aggrecan、TGF-β、p-Smad1、Smad1、β-actin 抗体等一抗（1∶500稀释）4 ℃孵育过夜，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）避光洗膜40 min，加入HRP标记的二抗（1∶500 稀释）避光孵育1 h，PBST 避光漂洗3 次，10 min/次。应用Odyssey 红外荧光成像系统扫描PVDF膜，收集影像分析各组条带灰度值。

1.4.4 外周血辅助性T 细胞（Th17）、调节性T 细胞（Treg）细胞检测 取各组大鼠外周血5 mL，采用Ficoll 密度梯度离心法将单个核细胞（PBMC）分离出来，以RPMI-1640 培养液调整细胞浓度至2×106个/mL待用。

Th17 细胞检测:将分离好的PBMC 加入24 孔板上，加入50 μg/L 的佛波酯，1 μmol/L 的离子霉素，750 μg/L 的莫能霉素，混合均匀后于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养5 h。完成后将24 孔板以2 000 r/min 离心10 min，弃上清，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2 次；加入FITC 标记的CD4 单克隆抗体，4 ℃避光条件下孵育20 min。根据Fixation/Permeabilisation 试剂盒的说明书进行透膜/固定30 min。加入藻红蛋白标记的IL-17 单克隆抗体，于对照管中加入同型对照抗体，室温避光反应30 min，染色后加入PBS重悬细胞然后上机检测。

Treg 细胞检测:将分离好的PBMC 加入24 孔板上，加入FITC 标记的CD4 单克隆抗体，4 ℃避光条件下孵育20 min。加入别藻蓝蛋白标记的CD25 单克隆抗体，根据Fixation/Permeabilisation 试剂盒的说明书进行透膜/固定30 min 后进行藻红蛋白标记的Foxp3单克隆抗体胞内染色。对照管中加入同型对照抗体，室温避光反应30 min，染色后加入PBS重悬细胞然后上机检测。

1.5统计方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。若正态分布、方差齐，多组比较采用单因素方差分析，若非正态分布或方差不齐，采用多个样本比较的秩和检验，进一步两两比较采用LSD-t检验或秩和检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠软骨病理损伤情况比较图2 结果显示:假手术组软骨表面光滑，无裂隙，细胞分布均匀，番红O 染色均染，无失染情况；模型组大鼠软骨出现大量的缺损及裂隙，细胞数减少，番红O 染色重度或完全失染；甘草甜素低剂量组软骨表面有裂隙生成，深达中间层，软骨细胞增多，同源细胞群增多，番红O 染色中重度失染；甘草甜素高剂量组软骨表面裂隙较少，表面平整，番红O 染色轻中度失染；来氟米特组软骨表面无明显裂隙，表面平整，番红O 染色均匀，无失染情况。

图2 各组大鼠软骨病理损伤情况比较（番红O染色，×200）Figure 2 Comparison of the features of rat cartilage pathological damage in various groups（by safranine oxygen staining，×200）

表1 各组大鼠软骨组织中Caspase-3、Caspase-9表达水平比较Table 1 Comparison of the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 in rat cartilage tissues in various groups（±s）

表1 各组大鼠软骨组织中Caspase-3、Caspase-9表达水平比较Table 1 Comparison of the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 in rat cartilage tissues in various groups（±s）

①P ＜0.05，与假手术组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与来氟米特组比较；④P ＜0.05，与甘草甜素低剂量组比较

组别假手术组模型组甘草甜素低剂量组甘草甜素高剂量组来氟米特组鼠数（只）蛋白活化水平Caspase-3 0.01±0.00 0.34±0.05①0.20±0.06①②③0.05±0.03①②③④0.01±0.01②mRNA相对表达水平Caspase-3 1.00±0.00 2.80±0.40①2.10±0.43①②③1.50±0.28①②③④1.23±0.30②Caspase-9 0.00±0.00 0.36±0.05①0.17±0.03①②③0.06±0.03①②③④0.01±0.01②6 6 5 5 6 Caspase-9 1.00±0.00 3.20±0.54①2.40±0.40①②③1.60±0.45①②③④1.20±0.30②

图3 各组大鼠软骨组织中Caspase-3、Caspase-9的Western Blot 电泳条带Figure 3 Western bloting strips of Caspase-3 and Caspase-9 in rat cartilage tissues in various groups

2.2各组大鼠软骨组织中Caspase-3、Caspase-9表达水平比较表1、图3 结果显示:与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织中Caspase-3、Caspase-9 mRNA 相对表达和蛋白活化水平显著升高（P ＜0.05）；与模型组比较，甘草甜素低、高剂量组和来氟米特组大鼠软骨组织中Caspase-3、Caspase-9 mRNA 相对表达和蛋白活化水平显著降低（P ＜0.05），且甘草甜素低、高剂量组和来氟米特组间比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.3各组大鼠软骨组织中软骨代谢相关蛋白MMP-1、MMP-13、CollagenⅡ、Aggrecan表达比较表2、图4 结果显示:与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织中MMP-1、MMP-13 蛋白表达水平显著升高（P ＜0.05），CollagenⅡ、Aggrecan 蛋白表达水平显著降低（P ＜0.05）；与模型组比较，甘草甜素低、高剂量组和来氟米特组大鼠软骨组织中MMP-1、MMP-13 蛋白表达水平显著降低（P ＜0.05），CollagenⅡ、Aggrecan 蛋白表达水平显著升高（P ＜0.05），且甘草甜素低、高剂量组和来氟米特组间比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

表2 各组大鼠软骨组织中软骨代谢相关蛋白MMP-1、MMP-13、CollagenⅡ、Aggrecan表达水平Table 2 Comparison of the expression levels of cartilage metabolism-related protein MMP-1，MMP-13，CollagenⅡand Aggrecan in rat cartilage tissues in various groups （±s）

表2 各组大鼠软骨组织中软骨代谢相关蛋白MMP-1、MMP-13、CollagenⅡ、Aggrecan表达水平Table 2 Comparison of the expression levels of cartilage metabolism-related protein MMP-1，MMP-13，CollagenⅡand Aggrecan in rat cartilage tissues in various groups （±s）

①P ＜0.05，与假手术组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与来氟米特组比较；④P ＜0.05，与甘草甜素低剂量组比较

Aggrecan 0.18±0.05 0.03±0.01①0.09±0.04①③0.12±0.04①②③④0.17±0.06②组别假手术组模型组甘草甜素低剂量组甘草甜素高剂量组来氟米特组鼠数（只）6 6 5 5 6 MMP-1 0.03±0.01 0.83±0.09①0.43±0.06①②③0.14±0.05①②③④0.06±0.04②MMP-13 0.05±0.03 0.52±0.06①0.35±0.07①②③0.15±0.05①②③④0.10±0.04②CollagenⅡ0.12±0.03 0.01±0.00①0.05±0.02①②③0.13±0.04①②③④0.15±0.04②

图4 各组大鼠软骨组织中MMP-1、MMP-13、CollagenⅡ、Aggrecan的Western Blot电泳条带Figure 4 Western bloting strips of MMP-1，MMP-13，CollagenⅡand Aggrecan in rat cartilage tissuesin various groups

2.4各组大鼠外周血中Th17、Treg细胞水平比较图5、表3 结果显示:与假手术组比较，模型组大鼠外周血中Th17 细胞水平均显著升高，Treg 细胞水平显著降低，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；与模型组比较，甘草甜素低、高剂量组和来氟米特组大鼠外周血中Th17 细胞水平均显著降低，Treg细胞水平显著升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05），且甘草甜素低、高剂量组和来氟米特组间比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

图5 各组大鼠外周血中Th17、Treg细胞分布比较（流式细胞术）Figure 5 Comparison of the distribution of Th17 and Treg cells in rat peripheral blood in various groups（by flow cytometry）

表3 各组大鼠外周血中Th17、Treg细胞水平比较Table 3 Comparison of the percentage of Th17 and Treg cells in rat peripheral blood in various groups（±s）

表3 各组大鼠外周血中Th17、Treg细胞水平比较Table 3 Comparison of the percentage of Th17 and Treg cells in rat peripheral blood in various groups（±s）

①P ＜0.05，与假手术组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与来氟米特组比较；④P ＜0.05，与甘草甜素低剂量组比较

Treg（%）31.0±6.0 2.1±0.6①5.9±1.6①②③19.6±3.8①②③④27.0±4.9①②组别假手术组模型组甘草甜素低剂量组甘草甜素高剂量组来氟米特组鼠数（只）6 6 5 5 6 Th17（%）1.4±0.9 37.0±4.9①21.0±3.7①②③9.0±2.8①②③④3.4±1.5①②

2.5各组大鼠软骨组织中TGF-β蛋白表达及Smad1活化水平比较图6、表4 结果显示:与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织中TGF-β 蛋白表达水平和Smad1 蛋白磷酸化水平显著升高（P ＜0.05）；与模型组比较，甘草甜素低、高剂量组和来氟米特组大鼠软骨组织中TGF-β 蛋白表达水平和Smad1 蛋白磷酸化水平显著降低（P ＜0.05），且甘草甜素低、高剂量组和来氟米特组间比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

图6 各组大鼠软骨组织中TGF-β、Smad1、p-Smad1蛋白的Western Blot电泳条带Figure 6 Western bloting strips of TGF-β，Smad1 and p-Smad1 proteins in rat cartilage tissues of various groups

表4 各组大鼠软骨组织中TGF-β蛋白表达及Smad2活化水平比较Table 4 Comparison of levels of TGF-β expression and Smad1 activation in rat cartilage tissues of various groups （±s）

表4 各组大鼠软骨组织中TGF-β蛋白表达及Smad2活化水平比较Table 4 Comparison of levels of TGF-β expression and Smad1 activation in rat cartilage tissues of various groups （±s）

①P ＜0.05，与假手术组比较；②P ＜0.05，与模型组比较；③P ＜0.05，与来氟米特组比较；④P ＜0.05，与甘草甜素低剂量组比较

p-Smad1/Smad1 0.01±0.01 0.15±0.03①0.08±0.03①②③0.03±0.01①②③④0.01±0.00②组别假手术组模型组甘草甜素低剂量组甘草甜素高剂量组来氟米特组鼠数（只）6 6 5 5 6 TGF-β 0.01±0.00 0.19±0.03①0.10±0.02①②③0.04±0.02①②③④0.01±0.01②

3 讨论

骨关节炎（OA）的发生与软骨细胞凋亡的关系密切。Caspase-3、Caspase-9 是Caspases 家族诱导细胞凋亡中的效应蛋白，在整个细胞凋亡通路中最终都是由Caspases-3 来行使凋亡功能，因此，Caspases- 3 水平与细胞凋亡关系密切， 而Caspases-9 则是Caspases 家族诱导细胞凋亡中最关键的启动子，在接受细胞凋亡信号及传递信号过程中发挥着重要的作用[8]。本研究通过切断前交叉韧带构建OA 大鼠模型，结果显示，模型大鼠软骨组织受损严重，出现大量番红O 失染情况，腹腔注射甘草甜素后能够改善OA 大鼠软骨组织损伤，且软骨组织中Caspase-3、Caspase-9 mRNA 及蛋白表达水平均显著上调，而用甘草甜素处理后能够抑制Caspase-3、Caspase-9的表达水平上调，表明甘草甜素可缓解骨关节炎引起的软骨细胞凋亡。该结果与卢伟等[9]研究结果一致。

目前，研究报道证实，OA 的发作可能与关节软骨细胞、细胞外基质（ECM）及软骨下骨降解及合成紊乱有关。关节软骨绝大部分组分为软骨基质，其余为软骨细胞，软骨的生理功能与其组分的形态及代谢稳定关系密切[10]，Collagen Ⅱ、Aggrecan 作为ECM 的主要成分，当软骨组织结构遭到损伤时，会引起ECM 异常降解，ECM 相关组分的合成也随之减少，加重软骨组织的退化，导致OA 发生[11]。MMP-1、MMP-13 作为基质金属蛋白酶家族（MMPs）的重要成员可降解ECM 中的CollagenⅡ、Aggrecan[12-13]。本研究结果显示，模型组大鼠软骨组织中CollagenⅡ、Aggrecan 表达水平明显降低，MMP-1、MMP-13 表达水平显著升高，而用甘草甜素处理后，CollagenⅡ、Aggrecan 表达水平升高而MMP-1、MMP-13 表达水平降低，表明用甘草甜素处理能够抑制软骨组织ECM 异常降解，促进ECM 组分的合成，进而缓解OA 的关节损伤。秦梦等[13]研究结果表明，MMP-1、MMP-13表达的下调、CollagenⅡ表达的上调是ECM 降解破坏改善的表现，本研究结果与此一致。

软骨组织的炎症反应也是引起或加重OA 的重要原因之一，Th17 和Treg 细胞在介导炎症反应、关节软骨及骨质破坏过程中发挥着重要的作用[14]。Th17 是一类CD4+T 淋巴细胞亚群，主要是通过分泌效应因子IL-17 促进MMPs 蛋白表达来抑制蛋白聚糖及胶原等ECM 组成成分的合成，从而加重软骨损伤[15]。Treg 细胞是一类具有免疫抑制活性的T淋巴细胞亚群，IL-10和TGF-β是其主要的效应因子，通过抑制T细胞及抗原细胞信号传递，从而抑制炎性细胞因子的合成及抗体的分泌[16]。Foxp3 是Treg 细胞的重要转录因子，其表达量与Treg 细胞的免疫抑制活性密切相关[17]，同时在体内能够促进Th2 型细胞因子的分泌，抑制CD8+T 细胞、NK 细胞及CD4+T 细胞对特异性抗原的反应，进而调节机体免疫功能[18]。本研究结果显示，模型组大鼠外周血中Th17 细胞水平显著升高，而Treg 细胞水平显著降低，表明OA 模型大鼠体内存在Th17/Treg细胞比例的失衡，并且向Th17 细胞偏移，而甘草甜素干预能够逆转Th17/Treg 细胞的失衡使其向Treg 细胞方偏移，调节CD4+T 淋巴细胞紊乱。周明伟等[19]研究发现，甘草甜素可以抑制免疫炎性反应，Th17/Treg细胞的失衡，本研究结果与此一致。

有研究[20]表明，TGF-β/Smad 信号通路参与到软骨组织的早期形成，并能够调控软骨细胞稳态及表型特征，是治疗OA 的一个潜在靶点。TGF-β在细胞增殖、识别、分化及凋亡过程中都发挥着重要的作用，能够被蛋白水解酶MMP-2、MMP-9及活性氧簇（ROS）等物质激活启动下游通路[21]。Smad 蛋白作为TGF-β/Smad 信号通路的核心作用因子，在哺乳动物中有8 个成员，可以形成2 条不同的信号通路对软骨细胞的终末分化过程起到完全相反的作用，TGF-β/Smad1 信号通路则会引起软骨细胞肥大[22]。本研究结果显示，模型组大鼠软骨组织中TGF-β 蛋白及Smad1 的磷酸化水平显著升高，而甘草甜素干预能够显著抑制这一过程，表明甘草甜素可能通过抑制软骨细胞中TGF-β蛋白合成，抑制Smad1 蛋白磷酸化，降低下游MMP-13蛋白合成，使OA 样软骨细胞表型受到抑制，从而减轻OA软骨组织损伤。

综上所述，甘草甜素能够修复OA 软骨组织的损伤，其机制可能是通过抑制TGF-β/Smad1 信号通路，限制MMP-1、MMP-13 蛋白的合成，进而抑制对骨代谢蛋白CollagenⅡ、Aggrecan 的降解作用，同时抑制软骨细胞凋亡，减轻OA 导致的免疫炎性反应，恢复Th17/Treg 细胞的平衡，从而发挥促进软骨组织修复及再生的作用。