熊仕俊， 孙成龙， 黄 波， 吴奇飞， 龙忠银

(1.安顺学院 农学院， 贵州 安顺 561000； 2.贵州中医药大学， 贵州 贵阳 550025)

草莓褐色叶斑病是一种新发现的草莓病害，在田间表现为叶片坏死和果实腐烂。2012年国内首次报道了病原菌Pilidiumconcavum在北京地区危害草莓导致草莓褐色叶斑病[1]。该病原菌首次在日本发现危害草莓，之后在波兰、巴西、比利时、美国和伊朗等地也有陆续报道[2-5]。目前，未见贵州草莓褐色叶斑病病原鉴定的相关报道。

通过常规的组织分离法对病原菌进行分离纯化，采用形态学观察和rDNA-ITS序列分析相结合的方法，对分离到的草莓褐色叶斑病病原菌进行鉴定，旨在查明贵州草莓褐色叶斑病病原菌的种类，为进一步探究其发生传播规律以及防控研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料采集

2018年11月至2019年6月，在贵州省贵阳市(花溪区三五三七厂、青岩)、遵义市播州区(八里、鸭溪)、安顺市西秀区(大寨村、罗仙村)等地的草莓基地，采集有典型褐色叶斑病症状的草莓病株，每个点采集3～5株，带回实验室进行分离。

1.2 病原菌的分离保存

采用常规的组织分离法[6]分离病原菌。从发病组织病健交界处，切取5 mm×5 mm的组织小块，先放在75%酒精中 5～60 s进行表面消毒，随后用5%次氯酸钠中浸泡3～5 min，再放在无菌水中清洗3次，用灭菌滤纸吸干组织表面水分后，将其转移到PDA培养基上，于25℃黑暗条件下恒温培养3～5 d。待其在培养基上长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝或单孢分离的方法进行纯化和转接培养病原菌。

按照柯赫氏法则[6]进行回接，回接后表现出与田间病叶相似褐色病斑症状，再进行病原菌的分离与纯化，于灭菌蒸馏水中4℃冰箱保存备用。……