王岁楼 张 沛

（中国药科大学工学院，江苏南京 211198）

类胡萝卜素作为一种重要的生理活性物质，在食品、医药和保健品等方面具有广阔的应用前景。类胡萝卜素种类繁多，广泛存在于水果蔬菜中。水芹是人们经常食用的水生蔬菜，含有芹菜素、黄酮、氨基酸、类胡萝卜素等功能成分，在其功能成分含量以及活性判定等方面仍具有很大的研究空间。本试验旨在探究水芹类胡萝卜素粗提物分离纯化的最优条件，并对其进行抗氧化活性判定，以期为水芹及其类胡萝卜素的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

水芹，购自南京农贸市场，经预处理和榨汁、有机溶剂提取，制得粗提物，供进一步分离纯化。

丙酮、石油醚、水杨酸、Tris、抗坏血酸、二苯代苦味肼基（DPPH）、邻苯三酚（焦性没食子酸） 等，均为分析纯；硅胶，100 目～200 目、200目～300 目，青岛海洋化工厂产品；β-胡萝卜素标准品，上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 主要仪器

电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；KH-100B 型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；754N 紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；TGL-16G 离心机，上海安亭科学仪器厂；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；全波长酶标仪Mutiskan GO，奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.3 β-胡萝卜素含量的测定

称取适量β-胡萝卜素标准品，用丙酮溶解定容于10 mL 棕色容量瓶中，得到系列质量浓度的标准品溶液。利用紫外分光光度计测定各质量浓度标准品在450 nm 最大吸收波长处的吸光度值，根据质量浓度与吸光度值的对应关系绘制标准曲线（图1），线性方程为y=0.098 8x+0.004 8，R2=0.999 1。在线性方程的辅助下计算样品中β-胡萝卜素含量。

图1 β-胡萝卜素标准溶液的浓度-吸光度值关系曲线

1.4 柱层析分离纯化

将填充用的硅胶G（100 目～200 目、200 目～300 目） 于110 ℃烘箱中烘干1 h 活化备用。称取适量的硅胶G，用丙酮与石油醚比例为1:20 的混合溶液溶解，进行湿法填柱，填柱过程中用吸耳球轻轻敲打柱身，柱子不能出现气泡以及裂缝，并保持填充剂上表面平整。沿管壁环形从柱顶慢慢加样，洗脱剂同样使用丙酮与石油醚比例为1∶20 的混合溶液进行洗脱，整个过程保证填充剂始终浸在洗脱剂中，不能使洗脱剂流干。维持适当的流速，对分离的黄色组分进行收集并鉴定成分。

1.5 类胡萝卜素结构鉴定

1.5.1 薄层色谱层析

取活化后铺好的薄层板，在离底边约1 cm～2 cm处用铅笔画一条基线，在基线上用毛细管分别点上β-胡萝卜素标准品和分离纯化后的水芹类胡萝卜素样品。因样品浓度较低可以适当多点几次，每次点完要晾干后再继续点样，以避免点样直径过大。将点好样的薄层板置于层析缸中在暗处展开，展开剂选用体积比为2∶1 的石油醚-丙酮混合液。在自然光下观察样品与标准品的展开状况。

1.5.2 紫外-可见光吸收光谱

利用酶标仪在200 nm～500 nm 区域内对分离纯化后的样品进行波长扫描，得到水芹类胡萝卜素分离纯化产物的紫外-可见光吸收光谱。

1.6 抗氧化活性测定

1.6.1 水杨酸法羟自由基清除率的测定

依参考文献［4］［5］进行，略有调整，按下式计算：

其中，A0、Ax、Ax0分别为空白组、样品组和对照组的吸光度值。

1.6.2 DPPH·自由基清除率的测定

依参考文献［6］进行，略有调整，按下式计算：

其中，A样品、A空白、A对照分别为样品组、空白组和对照组的吸光度值。

1.6.3 超氧负离子自由基清除率的测定

依参考文献［7］进行，略有调整，按下式计算：

其中，A1为以丙酮为参比溶液测定的不同浓度水芹类胡萝卜素提取液反应溶液的吸光度值，A0为空白对照组的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 水芹类胡萝卜素粗提物的分离纯化

2.1.1 洗脱剂对分离纯化的影响

采用洗脱剂和装柱溶剂一致的条件（采用常规方法，预试验用乙醇填充硅胶并不能很好的出现分离条带，因此选用一致的洗脱剂和装柱溶剂），进行丙酮与石油醚1∶10、1∶20、1∶30 的试验，发现以1∶10 的溶剂比为洗脱条件，不能出现黄色条带即不能分离出目标产物；1∶20、1∶30 的分离效果好，出现绿色和黄色条带且分离程度好，分离时间短。

2.1.2 填充物对分离纯化的影响

硅胶的分离效果比氧化铝的分离效果好，氧化铝分离速度慢，色素条带不清晰，需要高浓度的色素溶液上样才能出现清晰的条带。对硅胶的孔径大小（100 目～200 目、200 目～300 目） 进行比较试验，发现200 目～300 目硅胶做填充物时由于孔径较大，样品组分在柱中停留时间长，分离效率不高；而100 目～200 目孔径硅胶做填充物时能够以相对较快的速率完成组分分离。因此，100 目～200目孔径硅胶填充物分层效果更好。

2.1.3 柱径高比对分离纯化的影响

在对柱径高比的试验研究中，发现柱径高比为1∶3 时色素条带分离程度不够，与柱径高比为1∶4、1∶5 的分离柱相比柱长略短；柱径高比1∶5 时，叶绿素与类胡萝卜素的黄色与绿色条带分离明显，但是由于柱长过长，分离时间长，相比而言柱径高比为1∶4 时分离效果最好。

2.1.4 上样量对分离纯化的影响

在对上样量的试验研究中，采用1 mL、2 mL、3 mL 的梯度进行试验，发现经过柱层析分离后的类胡萝卜素成分含量相差不大。1 mL 上样量颜色较浅，对比度不高；2 mL 上样量适中，能够有效的进行分层判定；3 mL 上样量分层清晰，颜色明显。但由于分离后含量相差不大，说明上样量为3 mL 时，组分在柱子中与填充物结合较多，得到的产物量相对较少，而上样量为1 mL 时，颜色区分不明显不能满足操作要求，因此上样量2 mL 时分离效果最好。

2.1.5 最优分离纯化条件的确定

综合上述试验结果，最优分离纯化条件组合初步确定如下：选用孔径100 目～200 目硅胶G，填充柱径高比1∶4，上样量2 mL，洗脱剂与填充剂皆为丙酮：石油醚体积比1∶20，此时提取物类胡萝卜素含量均值可达3.39 μg/mL，纯化倍数为4.255 8/ 2.783 8=1.53，其中2.783 8、4.255 8 为样品在分离纯化前、后的β-类胡萝卜素含量。

2.2 水芹类胡萝卜素结构的鉴定

2.2.1 薄层色谱层析结果

展开剂选择石油醚与丙酮体积比为2:1 的混合溶剂，极性较低。由于水芹色素中的类胡萝卜素极性低，而叶绿素的极性高，根据相似相溶原理，类胡萝卜素在该展开剂中会被很快推到薄层板的前端。由于点样的样品是经过柱层析分离后的类胡萝卜素溶液，因此叶绿素的含量更少，在板中未出现多个斑点，只有黄色的β-胡萝卜素的斑点。在水芹色素粗提物中由于叶绿素含量多，β-胡萝卜素为占比较小的组分，因此先经分离纯化再进行薄层色谱层析，排除叶绿素的干扰。同时也可检测柱层析是否起到良好的分离效果。

图2 水芹类胡萝卜素与β-胡萝卜素标准品薄层色谱图

由图2 可见，水芹类胡萝卜素斑点与β-类胡萝卜素标准溶液同行展开，比移值时刻保持相同，因此可定性分离纯化后的水芹类胡萝卜素溶液为β-胡萝卜素。

2.2.2 紫外-可见光吸收光谱图

水芹类胡萝卜素溶液与丙酮的紫外可见光吸收光谱，见图3。

图3 水芹类胡萝卜素溶液与丙酮紫外可见光吸收光谱图

由图3 可知，两条谱线在200 nm～300 nm 之间大部分重合，因为样品溶解于丙酮中，排除溶液对样品吸收光谱的干扰；在440 nm～460 nm 处水芹类胡萝卜素溶液的吸收峰明显高于丙酮。参考β-胡萝卜素的特征吸收峰，可判断水芹类胡萝卜素溶液中的主要成分是β-胡萝卜素。

2.3 抗氧化活性的测定

2.3.1 水杨酸法羟自由基清除率的测定

不同质量浓度水芹类胡萝卜素Vc对羟自由基清除率如下页图4 所示。从图4 可看出，水芹类胡萝卜素质量浓度与羟自由基清除率总体上呈正相关，即β-胡萝卜素质量浓度越高其羟自由基清除率就越高。但通过与抗坏血酸对比，在相同质量浓度时，抗坏血酸的自由基清除率高于水芹β-胡萝卜素。在较高质量浓度时，水芹β-胡萝卜素也具有较高的自由基清除率，这为水芹的进一步开发利用提供了依据。

图4 水芹类胡萝卜素和Vc 对羟自由基的清除率

2.3.2 DPPH·自由基清除率的测定

DPPH·自由基的清除率可反应水芹β-胡萝卜素的抗氧化能力，根据公式计算，得到水芹β-胡萝卜素样品的清除率可达9.42%，说明在β-胡萝卜素这种自由基清除剂存在下，DPPH·的孤对电子与其配对颜色降低，证明水芹β-胡萝卜素具有较好的抗氧化活性。

2.3.3 超氧负离子清除率的测定

不同质量浓度水芹类胡萝卜素对超氧负离子的清除率见图5。

图5 水芹类胡萝卜素对超氧负离子的清除率

由图5 水芹类胡萝卜素对超氧负离子的清除率的关系可得出，随着β-胡萝卜素质量浓度的增加，其对超氧负离子的清除率也逐渐增加，且清除率在40%水平以上。这表明水芹对超氧负离子具有很强的清除作用。

3 结论

试验结果表明，采用柱层析技术对水芹类胡萝卜素粗提物进行分离纯化是可行的，当硅胶G 孔径大小为100 目～200 目，填充物柱径高比为1∶4，上样量2 mL，洗脱剂与填充剂皆为丙酮石油醚混合液（体积比1∶20），此时物质分层颜色对比清晰，分离效果较佳，纯化倍数可达1.53。

对分离纯化液进行薄层色谱层析以及紫外可见光吸收光谱检测，确定水芹中类胡萝卜素主要是β-胡萝卜素。同时3 种体外抗氧化活性试验皆表明水芹类胡萝卜素对不同自由基有不同清除能力，其中对超氧负离子清除效果最好，这为水芹类胡萝卜素的开发利用提供了依据。