张 秀，谭正怀，马苗苗，李晓媛，周 雪

豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制备与活性评价

张 秀，谭正怀*，马苗苗，李晓媛，周 雪

四川省中医药科学院，防治重大疾病中药药效学评价平台，四川省中药质量评价重点实验室，四川 成都 610041

通过基因工程技术生产的豆豉血栓溶解酶，研究其安全性及溶栓功效。采用酪蛋白平板从豆豉中分离获得具有纤溶活性的候选菌株，利用基因工程技术将其基因在大肠杆菌BL21（DE3）-pDE1中过表达AprE9912D重组蛋白。经过Ni-NTA纯化柱和透析纯化AprE9912D重组蛋白，体外采用纤维蛋白平板、溶解混合血栓考察溶栓作用，体内采用动静脉旁路血栓模型进行功效评价。同时对其安全性进行初步评估。经过分子鉴定，筛选出具有纤溶酶活性的菌株是贝莱斯芽孢杆菌9912D（9912D）。序列分析发现基因的开放阅读框有382个氨基酸，属于S8家族碱性丝氨酸蛋白，使用SWISS-MODEL同源预测AprE9912D蛋白3D模型。经过Ni-NTA柱纯化，AprE9912D纤溶酶蛋白相对分子质量约为36 000。体外测得AprE9912D纤溶酶酶活力为442.6 kU/mg，2.0 kU/mL AprE9912D纤溶酶就能有效溶解混合血栓，其溶解率为40.0%。在体内，4.0 kU/kg能显著抑制动静脉旁路血栓形成，抑制率为32.9%。体外溶血显示AprE9912D纤溶酶93.0 U/mL时，其溶血率为3.33%；测得小鼠静脉注射AprE9912D纤溶酶半数致死量（LD50）＞102.6 kU/kg。AprE9912D纤溶酶具有活性较强、安全性较高的特点，具有进一步开发的广阔前景。

贝莱斯芽孢杆菌；过表达；安全性；溶栓活性；血栓溶解酶；基因工程技术；大肠杆菌

流行病学研究结果显示，我国心脑血管疾病的发生率不断上升，心脑血管疾病死亡人数大约占人口总死亡数的40%～50%；……