BHK-21细胞用于塞内卡病毒培养最高代次范围研究

2021-01-19李建华张智明何世岷窦海燕

饲料博览 2020年8期

李建华，张智明，何世岷，窦海燕，方超，刘旭

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验动物

BHK-21细胞F11代，由哈药集团生物疫苗有限公司保存和提供。猪细小病毒L 株生产种子批E8代，由哈药集团生物疫苗有限公司制备、鉴定和保存。DMEM 培养基和0.25%胰酶，购自美国GIBCO公司；新生牛血清，购自美国Clark 公司。猪瘟病毒（CSFV）、细小病毒（PPV）和牛腹泻病毒（BVDV）荧光抗体均由中国兽医药品监察所提供。无菌检验用培养基：TG（硫乙醇酸盐培养基）、GA（酪胨琼脂）、GP（葡萄糖蛋白胨汤），均由哈药集团生物疫苗有限公司提供。支原体检验培养基购自北京海淀中海动物保健科技公司。0.5%豚鼠红细胞悬液按现行《中国兽药典》制备。40只2～4日龄裸鼠，购自哈尔滨医科大学附属第一医院动物室。

1.2 细胞传代

将生长良好的细胞单层，弃去上清，按培养液10%体积比加入0.25%胰酶-EDTA溶液，置37 ℃消化2～3 min，单层细胞分散后，去消化液，用含10%血清DMEM培养液冲洗瓶壁上细胞，稀释成每毫升含2.0×105个细胞后分装到细胞瓶中。按以上方法将BHK-21 细胞连续传代至F52代。取F11、F21、F31及F42代细胞进行细胞形态、无菌检验、支原体检验及外源病毒检测；取F31、F42及F52代细胞进行胞核学检查、细胞致瘤性检验及病毒培养适应性检验[1-6]。

1.3 细胞形态观察

用倒置显微镜进行细胞形态观察。

1.4 无菌检验和支原体检验

按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。

1.5 外源病毒检测

1.5.1 样品处理

取各代次细胞3 支，经3 次冻融后混合作为检品。

1.5.2 接种的细胞与样品的培养

（1）接种的细胞：将检品接种以下细胞：Vero细胞、MDBK细胞、PK15细胞。

（2）样品的接种与培养：将1.0 mL已处理的被检样品接种到已长成单层的上述细胞，另设一瓶未接种的正常细胞对照，并培养不少于14 d，其间至少继代1次。最后一次继代的细胞单层数量和培养面积应符合荧光抗体检查法、致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。

（3）判定：在至少14 d的培养期内，对细胞培养物进行常规检查，如果培养期间出现细胞病变，即判定为不符合规定。如无细胞病变，培养结束时，细胞单层应按以下方法检验。

1.5.3 检查方法

（1）荧光抗体检查法：最后一次继代的细胞单层培养5～7 d后用于荧光抗体检查。对每一种特定外源病毒的检验应至少包含三组细胞：①被检样品处理细胞；②最后一次继代时接种100～300 FAID50特定病毒的阳性对照细胞；③未加样品的阴性对照细胞。每一组细胞单层检查面积应不小于6 cm2。每一组细胞应按下列规定选择特异的抗病毒荧光抗体。①所有细胞均应检验：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）；②猪源细胞：猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）。

细胞单层样品经甲醇定后，用适宜的荧光抗体染色，检查每一组细胞单层是否存在特定外源病毒的荧光。阳性对照出现特异荧光，正常细胞无荧光时，如果被检样品出现外源性病毒特异性荧光，判为存在相应病毒污染而样品不合格。如果阳性对照组荧光不明显，或者正常细胞出现明显荧光，判为无结果，应重检。

（2）致细胞病变检查法：取经传代后培养至少7 d 敏感细胞单层（每个至少6 cm2）进行检验。用适宜染色液对细胞单层进行染色。观察细胞，检查包涵体、细胞融合形成的巨细胞、局部细胞坏死脱落或其他由外源病毒引起的CPE 出现情况。如果出现外源病毒所致的特异性CPE，判为样品不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为样品不合格。

（3）红细胞吸附性外源病毒检验：取经传代后培养至少7 d的敏感细胞单层（每个至少6 cm2）进行检验。以PBS（pH 7.2，下同）洗涤细胞单层2～3次。加入适量0.2%的豚鼠红细胞和鸡红细胞的等量混合悬液，以覆盖单层表面为准，红细胞悬液可以分别滴加于不同的细胞单层上。选2个细胞单层，分别在2～8 ℃和20～25 ℃放置30 min 后，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。如果出现外源病毒所致的红细胞吸附现象，判为样品不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为样品不合格。

1.6 胞核学检查

取各代次细胞，分别加入含0.1 μg·mL-1秋水仙素的培养液作用2～4 h，离心弃去培养液。用Eargle's等渗盐水清洗，离心弃去液体，加入含1%酚红的低渗液（1 L 水加入4 滴1 mol·L-1NaHCO3），37 ℃作用30 min。加入醋酸/甲醛固定液，与细胞反应25 min。在加热板上加热至60 ℃左右，滴加1 mol·L-1盐酸作用10 min。用姬姆萨染色液染色后油镜下观察，取50 个处于有丝分裂中期的细胞进行检查，对染色体计数，观察染色体组型。

1.7 细胞致瘤性检验

1.7.1 试验分组

用裸鼠20 只，随机分成3 组。第1 组10 只裸鼠，皮下接种107 个待检细胞；第2 组5 只裸鼠，皮下接种107 个人宫颈癌细胞（HeLa）作为阳性对照；第3 组5 只裸鼠，皮下接种107 个人胚肺成纤维细胞（MRC-5）作为阴性对照。以上细胞均悬浮于200 μL细胞培养液。

1.7.2 观察与剖检

接种后每日观察有无结节或肿瘤形成，21 d剖检第1 组裸鼠5 只；剩余5 只裸鼠，继续观察，12周后全部剖检。阳性和阴性对照组观察21 d全部剖检，剖检后观察淋巴结和器官有无结节形成。

1.8 病毒培养适应性检验

1.8.1 病毒培养

按培养液体积0.5%比例，将毒种接种到各代次长满单层的BHK-21 细胞，置37 ℃中吸附1 h，加入含2%新生牛血清的DMEM培养液。置37 ℃含5% CO2培养箱培养，当细胞病变达到80%以上时，收获细胞及细胞培养物。

1.8.2 病毒含量

将BHK-21细胞制备为单细胞悬液铺于96孔细胞培养板，每孔100 μL（细胞含量7.0×104个·mL-1，置37 ℃含5%CO2培养箱中培养24 h。将收获的病毒液用DMEM 培养基作10 倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度，各加入培养24 h的96孔细胞培养板，每个稀释度接种96孔细胞培养板6孔，每孔100 μL，同时设立正常细胞6孔为阴性对照。上述细胞孔加入含2%新生牛血清的DMEM 培养液，每孔100 μL。置37 ℃含5%CO2培养箱中培养4 d，每天观察和记录各孔中病毒感染情况，按Reed-Muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度（TCID50）。