李建华，张智明，何世岷，窦海燕，方 超，刘 旭

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验动物

BHK-21细胞F11代，由哈药集团生物疫苗有限公司保存和提供。猪细小病毒L 株生产种子批E8代，由哈药集团生物疫苗有限公司制备、鉴定和保存。DMEM 培养基和0.25%胰酶，购自美国GIBCO公司；新生牛血清，购自美国Clark 公司。猪瘟病毒（CSFV）、细小病毒（PPV）和牛腹泻病毒（BVDV）荧光抗体均由中国兽医药品监察所提供。无菌检验用培养基：TG（硫乙醇酸盐培养基）、GA（酪胨琼脂）、GP（葡萄糖蛋白胨汤），均由哈药集团生物疫苗有限公司提供。支原体检验培养基购自北京海淀中海动物保健科技公司。0.5%豚鼠红细胞悬液按现行《中国兽药典》制备。40只2～4日龄裸鼠，购自哈尔滨医科大学附属第一医院动物室。

1.2 细胞传代

将生长良好的细胞单层，弃去上清，按培养液10%体积比加入0.25%胰酶-EDTA溶液，置37 ℃消化2～3 min，单层细胞分散后，去消化液，用含10%血清DMEM培养液冲洗瓶壁上细胞，稀释成每毫升含2.0×105个细胞后分装到细胞瓶中。按以上方法将BHK-21 细胞连续传代至F52代。取F11、F21、F31及F42代细胞进行细胞形态、无菌检验、支原体检验及外源病毒检测；取F31、F42及F52代细胞进行胞核学检查、细胞致瘤性检验及病毒培养适应性检验[1-6]。

1.3 细胞形态观察

用倒置显微镜进行细胞形态观察。

1.4 无菌检验和支原体检验

按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。

1.5 外源病毒检测

1.5.1 样品处理

取各代次细胞3 支，经3 次冻融后混合作为检品。

1.5.2 接种的细胞与样品的培养

（1）接种的细胞：将检品接种以下细胞：Vero细胞、MDBK细胞、PK15细胞。……