宫祥博 ，延海莹，田迎樱，王顺涛，王百川，王鹏*

1. 中国海洋大学食品科学与工程学院（青岛 266003）；2. 中国农业大学烟台研究院（烟台 264000）；3. 烟台欣和企业食品有限公司（烟台 264006）

红树莓（Rubus idaeusL.）又名覆盆子、托盘、马林等，属蔷薇科悬钩子属，广泛分布于温带地区。其果实多汁、酸甜可口，营养物质含量丰富，被誉为“黄金水果”[1-2]。相关研究表明，红树莓中含有优质的黄酮类、酚酸类和萜类等生理活性物质，能够有效清除机体中的自由基，缓解细胞组织过氧化损伤，具有良好食用和药用价值[3-4]。

果酒通常指以水果为主要原料酿造的饮料，酒精度较低，一般在10%～12%vol，在具备酒香特质的同时，保留水果中的特色成分，较于传统蒸馏酒品具有较高的营养价值。随着生物技术的日新月异，多种营养价值丰富的水果得到开发利用，蓝莓果酒[5]、柑橘果酒[6]、桑葚果酒[7]等产品逐渐进入日常生活。树莓作为新兴的第三代小浆果，含有丰富酚类小分子功能成分，逐渐成为果酒开发的优质潜在原料之一。

因此，以成熟期红树莓为主要原料，建立树莓果酒的发酵工艺。对发酵过程中的特征性功能黄酮类因子进行定量测定，通过体外抗氧化和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化应激损伤保护作用进行发酵效果的评估，以期确定最优发酵工艺和红树莓果酒的陈酿状态，为红树莓的加工利用及高值化产品的开发提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

红树莓（烟台康世缘树莓合作社种植基地）；71B降酸型酵母（法国LAFFORT公司）；RV171型酵母（安琪酵母股份有限公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；多种抗氧化酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；葡萄糖、乙醇、芦丁等（均为国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；UV-6000PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；DL-CJ-1N型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；BJ5060UV型CO2培养箱（德国Heraeus公司）；HWS-24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 红树莓果酒制备工艺流程

红树莓→预处理→酶解→榨汁→成分调配→接种果酒酵母→主发酵→倒灌、陈酿→下胶、澄清→二次倒灌→过滤→灌装→杀菌→产品

1.3.2 发酵工艺及组别设置

以调节糖度的红树莓果汁为主要发酵原料，辅以菌株生长的必需营养元素；将活化的酵母菌按体积分数5%接种量无菌接入发酵罐中发酵。在主发酵工艺设置方面，根据2种不同果酒酵母和3个适宜发酵温度区间设置6组主发酵工艺，依次为1号（71B酵母，发酵温度24～28 ℃）、2号（71B酵母，发酵温度20～24℃）、3号（71B酵母，发酵温度15～20 ℃）、4号（RV171酵母，发酵温度24～28 ℃）、5号（RV171酵母，发酵温度24～28 ℃）、6号（RV171酵母，发酵温度15～20 ℃）。

1.3.3 理化指标的测定

参照国家标准GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对红树莓果酒样品的酒精度、总糖含量和总酸含量进行测定[8]。

1.3.4 花色苷含量测定

采用pH比色示差法测定总花色苷的含量[9]。取2 mL待测样品液，分别加入pH 1.0和pH 4.5缓冲液，定容至20 mL，振荡混匀之后于4 ℃静置2 h。分别于510 nm波长和700 nm波长处测定记录吸光度。花色苷含量的计算方法如式（1）和（2）所示。

式中：A为吸光度；V为提取液总体积，mL；m为取样品质量，g；26 900为矢车菊素-3-葡萄糖苷摩尔消光系数；449.2为矢车菊素-3-葡萄糖苷摩尔质量。

1.3.5 总黄酮含量测定

采用硝酸铝-亚硝酸钠的方法测定总黄酮的含量[10]。以参考文献方法绘制标准曲线。在样品测定方面，取适量待测液，加入30%乙醇补充至5.0 mL，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液混合均匀，静置6 min后，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，继续静置6 min后，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液及0.4 mL超纯水，摇匀后静置15 min，于510 nm处测吸光度，代入标准曲线计算出总黄酮含量。

1.3.6 体外抗氧化评价

使用Fenton反应体系测定·OH清除能力[11]。反应体系包括1 mL水杨酸-乙醇溶液、FeSO4溶液和不同浓度的样品液，加入1 mL的H2O2开始反应，在37 ℃保温30 min后，在510 nm处测定吸光度A1。考虑到多糖本身的吸光度，以蒸馏水代替H2O2，测定多糖的本底吸光度A2。按文献[11]方法计算·OH清除率。

1.3.7 HUVEC氧化应激损伤的保护作用

HUVEC损伤细胞存活率测定，使用DMEM培养基培养细胞。培养24 h细胞贴壁后，分别加入不同的果酒冻干粉，质量浓度梯度为25，50，200和400 μg/mL，设置4个复孔，每孔加样200 μL。孵育24 h之后，将培养基吸出，每孔加入300 μmol/L叔丁基过氧化氢（t-BHP）继续培养4 h。同时设置空白对照组、模型组（只添加t-BHP）和红树莓果酒冻干粉组作为对照。使用MTT法检测细胞存活率。

细胞抗氧化酶的测定参照南京建成生物工程研究所购买的抗氧化酶检测试剂盒的操作方法，分别对乳酸脱氢酶（LDH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）的含量进行测定。

1.4 统计分析

利用Excel软件和SPSS 22.0软件对数据进行统计分析和处理，每组试验均重复3次。

2 结果和讨论

2.1 红树莓发酵果酒指标检测

2.1.1 酒精度测定

在发酵过程中，酵母菌可将红树莓中的天然糖类成分转化为乙醇，并累积于果酒中，使得果酒具有一定酒精度。酒精度不仅能够反映酒品中酒精的产生情况，也是体现果酒发酵进程的重要指标[6]。在红树莓果酒的发酵过程中，6种不同发酵条件酒精度如表1所示。在起始糖浓度相同的条件下，发酵终点时刻的酒精度均在12.0%vol左右。

表1 6种样品的酒精度分析

2.1.2 发酵果酒样品营养成分分析

发酵前后不同工艺制备的红树莓果酒营养成分解析结果如表2所示。发酵后期总糖浓度显著下降，主要因为其作为酵母菌生长的碳源被分解利用。花色苷在发酵前后含量变化不显著。发酵后期总黄酮浓度显著升高，表明菌体在生长过程中，将大分子物质分解为黄酮类小分子物质。对比不同发酵工艺制备的果酒样品可知，4号样品中总酸浓度较低，特征性营养成分花色苷和总黄酮浓度分别为11.49和49.78 mg/100 mL，均高于其他果酒样品，效果最佳。

表2 不同样品的营养组分分析

2.2 红树莓果酒体外抗氧化评价

2.2.1 羟自由基（·OH）清除

图1 不同样品的自由基清除能力

羟自由基可通过电子转移、脱氢或者加成的方法同体内的多种分子进行作用，从而造成人体营养物质的氧化，结果导致细胞突变或者坏死[13]。不同红树莓果酒对体外羟自由基的清除效果如图1（A）所示。结果表明，发酵后样品较于原料树莓汁·OH清除效果较好。4号样品清除效果最优，主要是由于其中含有较高的花色苷、黄酮类抗氧化物质[14]。

超氧阴离子是由酶系统自氧化与无酶系统电子转移而产生的，通常与羟基进行结合，产物对机体DNA有损伤效果，从而破坏机体功能[4]。如图1（B）所示，不同发酵条件的红树莓果酒对超氧自由基的清除效果也不尽相同。与羟自由基清除效果相似，发酵后样品的超氧自由基清除效果显著提高，且4号样品清除效果最佳，即采用RV171酵母发酵，温区24～28 ℃发酵制备的果酒样品，超氧自由基清除效果可达61.09%。

2.3 红树莓果酒对HUVEC氧化应激损伤的保护效果评价

2.3.1 细胞损伤修复效果评价

在细胞水平试验方面，建立t-BHP损伤的HUVEC模型，并进行4号样品浓度梯度探究。试验结果如图2所示，通过空白对照组与模型组对比，t-BHP处理后HUVEC细胞存活率降为63.57%（p＜0.01），表明t-BHP造成显著细胞氧化损伤。通过模型组与试验组对比，受试物可以显著提高细胞存活率。发酵9 d组的细胞存活率效果最好，且相较模型组均显著提高，表明随着发酵进程进行，红树莓果酒发酵液可有效改善HUVEC被t-BHP造成的氧化损伤。

图2 不同发酵天数红树莓果酒冻干粉对t-BHP导致的HUVEC细胞存活率的影响

2.3.2 对LDH的影响评价

细胞受到氧化损伤或死亡时，细胞膜结构会被破坏，LDH会被大量释放到上清培养液中，所以测定上清中LDH水平可以一定程度反映细胞损伤程度[14]。试验结果如图3（A）所示，通过正常组与模型组对比，经t-BHP处理细胞后，上清液中的LDH释放量增加401.39%（p＜0.01），表明t-BHP造成细胞膜破坏。发酵1，5和9 d的红树莓果酒样品均能显著降低上清液中的LDH释放量，发酵9 d果酒样品效果最佳。结果表明，随着发酵时间延长，红树莓果酒对细胞具有更好的氧化应激保护作用，能够保护细胞膜的结构及完整性。

图3 红树莓果酒冻干粉对t-BHP导致的HUVEC氧化损伤保护作用

2.3.3 对GSH-PX的影响评价

GSH-PX是机体中广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，是研究细胞抗氧化能力的一种重要指标[15]。不同发酵时间红树莓果酒对GSH-PX的影响效果如图3（B）所示，通过模型组与正常组对比，t-BHP导致GSH-PX降低44.06%（p＜0.01），表明模型组构建成功。随着发酵时间延长，细胞内GSH-PX浓度逐渐提高，发酵9 d的红树莓果酒样品处理的细胞，其GSHPX浓度与正常组浓度相似，表明红树莓果酒有利于细胞抗氧化系统恢复。

3 结论

在试验过程中，以红树莓为主要原料进行发酵果酒的制备，建立最优发酵工艺，通过体外自由基清除试验与细胞损伤保护试验进行果酒抗氧化效果评价。研究发现，RV171型酵母在24～28 ℃控温条件下，发酵效果良好，且在羟自由基（·OH）和超氧自由基（O2-·）清除试验中效果显著。最适条件下发酵9 d的果酒样品具有更好的细胞损伤保护效果，与模型组相比，试验组能显著降低细胞上清液中LDH含量，并显著升高GSH-PX含量，说明红树莓发酵果酒具有良好抗氧化效果。与此同时，也为红树莓相关功能性健康食品的研发提供借鉴。