夏秋霞， 段腾飞， 柳雅丽， 李 瑞， 贾健凯

(1.宿州学院,安徽 宿州 234000;2.宿州市天然产物与功能性食品工程技术研究中心，安徽 宿州 234000)

0 引 言

酸浆果(Physalis peruviana L.)又名灯笼果、菇凉果，口感适中有酸甜味，又因为其中富含多种微量营养物质例如Vc、胡萝卜素等，所以深受我国北方人群喜爱[1-2]。同时酸浆果也是一种中草药植物[3]，具有消除炎症，促进排尿解毒的功效[4]，文献研究表示，酸浆果成分中的超临界二氧化碳萃取物对脂多糖引起的炎症能达到有效的抑制与治疗作用[5]。除此之外，酸浆果中含有的黄酮[6]，能够在降低体循环的动脉血压和预防血管内栓塞方面有显著的疗效[7]，同时在抗氧化、消除炎症、抗自由基作用与抑菌、抗病毒以及预防肿瘤等方面都有一定的积极影响。

有关酸浆果的食用与药用价值的研究较多，关于真空耦合超声波技术提取酸浆果中的黄酮的报道较少，目前黄酮的提取研究一般采取有机试剂浸提、微波提取、超临界流体萃取、超声波等。真空耦合超声波具有作业环境要求低、提取时间短、提取率高、仪器设备少等优点[9]。采取真空耦合超声波技术对酸浆果内的黄酮成分进行提取优化，从而提高提取效率，为酸浆果的开发和利用提供一定数据参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验器材

1.1.1 实验原料与试剂

实验原料：酸浆果购于大润发超市，成熟度好、大小均匀，无霉变。

实验试剂:芦丁标准品、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等，购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.1.2 实验仪器

超声波SYU-3-100DT(郑州生元有限公司)、电热鼓风干燥箱DHG-9245A(上海一恒科学仪器有限公司)、中草药粉碎机XL-04B、真空旋转蒸发仪RE-52-864(上海亚荣生化仪器厂)、可见光光度计722(上海元析仪器有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准使用液(0.2 mg/mL)：根据表1利用亚硝酸钠—硝酸铝法获得待测液[12-13]。将待测液在分光光度计510 nm波长下进行测定，得出线性回归方程[14]。

表1 标准曲线配制表

1.2.2 酸浆果粉末、果汁中黄酮含量的比较

液态待测液制备：将酸浆果打浆均匀，称取酸浆果汁于圆底烧瓶中，加入70% (v/v)乙醇，采用真空耦合超声波进行黄酮提取，将提取液进行真空抽滤[15]，结束后将其转移至25 mL(或50 mL)容量瓶中用70%乙醇进行定容。固态待测液的制备：将酸浆果切片干燥研磨成粉末状，经过50目筛得到酸浆果粉末，同上述操作定容得到待测液。

取2 mL上述容量瓶中的待测液内于试管内，加入60 % (v/v)乙醇2 mL，然后加利用亚硝酸钠—硝酸铝法制备黄酮待测液，将得到的待测液在510 nm处测得吸光值。

1.2.3 提取率的计算方法

V为定容的体积，mL;C为由标准曲线计算得到的黄酮浓度，mg/mL;m为所测样本质量，mg

1.2.4 单因素实验

本次实验选取超声波功率、超声温度、料液比、真空度和超声提取时间五个因素进行单因素实验，探究各个单因素对提取酸浆果中黄酮提取率的影响[16]。

1.2.4.1 超声波功率对黄酮提取率的影响

称取1g(±0.002g)酸浆果粉末，将其质量记为m(精确到0.0001g)后转移至干净圆底烧瓶内，再量取20 mL 70%(v/v)的乙醇移入圆底烧瓶内，真空度0.06 MPa，超声时间为50 min，水浴加热温度设定为50℃，依次探索超声功率在100 W，120 W，140 W，160 W和180 W情况下酸浆果中黄酮提取率[17]。

1.2.4.2 真空度大小对黄酮提取率的影响探究

称取1g(±0.002g)酸浆果粉末，将其质量记为M(精确到0.0001g)后转移至干净圆底烧瓶内，再量取20 mL 70%(v/v)的乙醇移入圆底烧瓶内, 以超声功率160 W、超声时间为50min、温度为50℃为实验控制条件[18-19]，分别测定0 MPa、0.02 MPa、0.04 MPa、0.06 MPa、0.08 MPa、0.1MPa酸浆果中黄酮提取率大小。

1.2.4.3 温度对黄酮提取率的影响

称取1g(±0.002g)酸浆果粉末，将其质量记为M(精确到0.0001g)后转移至干净圆底烧瓶内，再量取20 mL 70%(v/v)的乙醇移入圆底烧瓶内, 以超声功率160 W、真空度0.06 MPa、超声时间为50 min为实验控制条件，分别探索超声时温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃情况下酸浆果中黄酮提取率大小。

1.2.4.4 料液比对黄酮提取率的影响

称取1g(±0.002g)酸浆果粉末，将其质量记为m(精确到0.0001g)后转移至干净圆底烧瓶内，以超声功率160 W、温度为60℃，真空度0.06 MPa、超声时间为50 min为实验控制条件，分别探索向圆底的烧瓶内移取70 % (v/v)乙醇体积分别为10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL情况下酸浆果中黄酮提取率大小。

1.2.4.5 超声时间对黄酮提取率的影响

称取1g(±0.002g)酸浆果粉末，将其质量记为M(精确到0.0001g)后转移至干净圆底烧瓶内，再量取30 mL 70%(v/v)的乙醇移入圆底烧瓶内，分别将超声功率设为160 W，真空度为0.06 MPa、温度60℃，在此实验条件下，分别探索超声时间为30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min情况下酸浆果中黄酮提取率大小[20]。

1.2.5 响应面优化设计

在对单因素实验的结果进行分析汇总后，依据Box-benhnken软件的中心组合原理设计出优化设计实验方案，以温度(A)、时间(B)、功率(C)、料液比(D)这四个因素作为自变量，以Y(黄酮总含量)为考察的响应值。实验方案如下图表2所示。

表2 响应面法因素水平设计表

2 结果分析

2.1 芦丁的标准曲线

由图1可见，芦丁的浓度C(mg/mL)和吸光值A的标准线性回归方程是y=0.3139x+0.0052(R2=0.9992)，通过方程可以发现，当标液的质量浓度在0.025～0.2 mg/mL之间时，C与吸光度A之间线性关系为最优。

2.2 酸浆果粉末、果汁中黄酮含量的比较结果

由图2可知相同条件下，酸浆果粉末比酸浆果汁黄酮提取率要高0.011%。原因可能是酸浆果果汁内含有较多糖分及其他成分，不易于黄酮物质溶出，对实验结果造成干扰。酸浆果粉末经烘干粉碎后，内部有效成分已经初步浓缩，超声辅助提取法能较有效的利用空洞、震动机理对黄酮物质进行提取，提高提取效率。故本实验采用酸浆果粉末提取黄酮。

图1 芦丁的标准曲线

图2 酸浆果粉末和果汁中黄酮提取率

图3 超声功率对黄酮提取率的影响

2.3 超声功率对黄酮提取率的影响

从图3可知，在超声功率达到160 W之前，黄酮提取率随超声功率的增强而提高，由100 W时的0.053%提高到160 W时的0.148%，提取率提高了0.095%，并在160 W时达到最高值。原因可能是随着超声功率的不断加强，萃取过程中形成和崩塌的气泡较多，强烈的冲击波和高剪切梯度可能导致细胞壁的破坏，这就促进了细胞内化合物化合物的释放，同时提高了传质速率，从而提高了黄酮的产率。当超声功率大于160W后黄酮提取率随超声功率增强而下降，当功率达到180 W时提取率已经下降到0.126%。这可能是因为在超声功率过高的情况下，黄酮结构在此过程中发生破坏或分解。所以最佳超声功率为160 W。

2.4 真空度对黄酮提取率的影响

由图4可知，在0～0.06 MPa时，随着真空度增加黄酮提取率提高，当真空度大于0.06 MPa时黄酮提取率与真空度成负相关。当真空度由0 MPa增加到0.04 MPa，黄酮提取率从0.128%提高到0.142%。真空度增加到0.1 MPa时，黄酮提取率出现明显下降趋势，提取率由0.143%下降到0.084%。当真空度达到0.08 MPa时，圆底烧瓶内提取液出现微沸现象，此条件下提取率下降可能是高温破坏了黄酮结构导致，当真空度达到0.1 MPa后由于反应容器体积小真空度大，反应蒸汽无法有效回流，冷凝管接口部分出现倒吸现象，使得提取物含量受损。综上所述当最佳真空度为0.06 MPa。

2.5 温度对黄酮提取率的影响

从图5中可知，当温度为40～60℃时，提取液中的黄酮含量与温度变化呈正相关，黄酮提取率从0.125%提高到0.181%。黄酮提取率在温度为60℃时达到最高值，当温度达到80℃时，黄酮提取率下降到0.101%，原因可能是随着温度的提高黄酮成分可能被分解或变性，也有可能此时提取溶剂乙醇挥发速度大于回流速度导致提取效率下降[21]。由上所述超声最佳提取温度为60℃。

2.6 料液比对黄酮提取率的影响

从图6可知，当料液比为1：10～1：30时，提取率随乙醇含量的增加而上升，由0.161%提高到0.221%，原因可能是当乙醇体积较少时细胞内外渗透压不显著导致分子从细胞向溶液扩散效率下降，当料液比达到1：30时提取率达到最大，且料液比的不同也会给黄酮的提取带来一定程度上的影响。当料液比在1：30～1：50之间时黄酮提取率呈下降趋势，当料液比达到1：50时提取率下降至0.162%。综合考虑，当料液比为1：30时最佳。

图4 真空度对黄酮提取率的影响

图5 温度对黄酮提取率的影响

2.7 超声的时间对黄酮提取率的影响

从图7中可知：在30～60 min时黄酮提取率与超声时间呈线性关系，提取率由0.144%提高到0.224%。当超声时长经过拐点后，即达到70 min时，黄酮提取率不仅没有提高，反而出现下降现象，80 min时提取率下降到0.169%。原因可能是随着超声时间的增加，提取液中黄酮成分发生分解现象，导致浓度降低，也有可能是随着超声提取时间增长，酸浆果粉末中其他成分也被析出，导致黄酮提取率下降，另外不排除上述两种原因的综合影响从而出现该种现象。所以超声时间选择60 min较佳。

表3 响应面优化实验结果

2.8 响应面优化实验结果分析

2.8.1 模型的建立

利用Design-Expert8.0.6软件对实验结果分析，在二次多项式回归模型方程拟合后得到关于该实验方案中四因素三水平，24个试验点、5个零点与总黄酮提取率的二次回归模型方程为[22]：

Y=4.42+0.015A+0.030B+0.080C+

0.043D-0.026AB+0.0015AC+0.035AD+

0.00425BC+0.056BD-0.042CD-0.35A2-

0.34B2-0.34C2-0.34D2

2.8.2 方差分析

由表4可知：因为P<0.0001，所以可以表明此模型极为显著；回归方程决定系数R2=0.9805，修正后决定系数R2=0.9610，该模型能有效拟合真实实验，能较为理想的反应各因素与响应值Y的关联程度；失拟项P=0.2880大于0.05说明其他因素的对结果影响不显著；其中交互项和一次项A、B与响应值Y都不显著，二次项极为显著，一次项C高度显著，一次项D差异显著。方差分析结果表明所建模型各因素与响应值不是单纯的线性关系[23]。

表4 响应面方差分析结果

图6 料液比对黄酮提取率的影响

2.8.3 响应曲面分析

由图8可知，四个因素对酸浆果粉末中黄酮提取率的影响大小分别为：料液比>时间>温度>超声功率[23]，在响应面图坡度越陡这四个因素对黄酮提取率影响越大，为了得到以超声波辅助法提取酸浆果总黄酮量的最佳理论参数，现设定最大黄酮提取率，将其作为最优的提取因素，最终得到的最佳理论参数为：提取温度60.63℃、超声功率为162.18 W、料液比为1：30.54、超声时间为60.24 min，在最佳理论参数条件下，最终预测的最大总黄酮提取量为2.25 mg/g。考虑实际操作性，最终确定最优提取工艺为：超声波功率162 W、提取温度60℃、料液比1:30、超声时间为60 min。在此条件下进行验证型实验，结果测得总黄酮提取量为2.25 mg/g。

图7 超声时间对黄酮提取率的影响

图8 响应面结果图

3 结 论

利用真空耦合超声波提取工艺提取酸浆果中的黄酮，通过响应面法考察了料液比、超声时间、温度、超声功率等因素，确立了最优提取条件模型。通过模型及验证性实验得出的最优工艺实验条件为：料液比(v/v)1:30、温度60℃、超声波功率162W及真空度为0.06 MPa时对酸浆果粉末超声60 min为最佳黄酮提取条件，在该实验条件下酸浆果中黄酮提取率高达0.225%。测得的真实值与响应面回归模型相吻合，决定系数R2达到0.9610，该模型能有效拟合真实实验。真空耦合超声波具有操作简便、提取率高、仪器设备少等优点，提高了黄酮提取率，为酸浆果的开发利用提供一定的数据参考。