谷 瑶，曾永明，陈松武，杨 漓，周丽珠

（广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁 530002）

核桃（Juglans sigillataL.），属胡桃科（Juglandaceae） 植物，最初产于西亚、欧洲的东部和南部[1-3]。核桃仁含有丰富的蛋白质、脂肪和碳水化合物，每100 g 含蛋白质15～20 g，是一种公认的高蛋白的食品，有“长寿果”“养生之宝”的美誉。同时，也含有人体必需的钙、磷、铁等多种微量元素和矿物质，以及胡萝卜素、核黄素等多种维生素，对人体有益，是深受老百姓喜爱的坚果类食品之一[4]。核桃仁中可溶性蛋白的组成以谷氨酸为主，其次为精氨酸和天冬氨酸[1]。

食品中蛋白质的测定方法有两类：直接法和间接法[5]。杜马斯燃烧法和凯氏定氮法是使用最广泛的间接法[6-7]，而近红外光谱法、紫外分光光度法、电泳法、紫外吸收光谱法和Bradford 法是常见的直接法[5]。凯氏定氮法灵因敏度高、稳定性好、成本低廉，是目前进行氮含量测定常见的方法，也是国内外法定的检测方法[8]。目前，大量文献报道了凯氏定氮法测定食品中蛋白质，但针对特定食品蛋白质的研究仅限于大豆、小麦、乳制品和大米[9-15]。由于食品基质复杂，普适性方法需要根据实际情况进行适当调整和改进，有必要针对性地建立核桃蛋白质检测方法，在最短的时间内得到更精准的结果。试验参照《GB 5009.5—2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定核桃仁中蛋白质含量[16]，通过进行方法优化，得到精准的含量值，为核桃蛋白质快速、准确测定提供了科学参考。

方法原理：蛋白质是含氮的有机化合物。核桃与硫酸和催化剂一同加热消解，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。其反应式如下：

1 材料与方法

1.1 试剂

硫酸铜（CuSO4·5H2O）、硫酸钾（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、硼酸（H3BO3）、甲基红指示剂（C15H15N3O2）、溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）、氢氧化钠（NaOH）、95%乙醇（C2H5OH）、盐酸（HCl）、无水碳酸钠（Na2CO3） 基准试剂、硫酸铵（(NH4)2SO4） 标准品，除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为三级水。

试验原料：核桃，广西凤山县核桃专业合作社提供。

1.2 试剂配制

（1）硼酸溶液（20 g/L）。称取20 g 硼酸，加水溶解后并稀释至1 000 mL。

（2）氢氧化钠溶液（30%）。称取300 g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至1 000 mL。

（3）盐酸标准滴定溶液[C(HCl)]0.1 moL/L。量取9 mL 分析纯浓盐酸（HCl）于1 000 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀；称取于270～300 ℃高温炉中灼烧至恒质量的工作基准试剂无水碳酸钠0.2 g（精确到0.000 1 g）溶于50 mL 水中，加10 滴溴甲酚绿- 甲基红指示液，用配制的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2 min，加盖具钠石灰管的橡胶塞，冷却，继续滴定至溶液再呈暗红色；同时做空白试验，准确计算盐酸标准滴定溶液浓度[C（HCl）]。

（4）甲基红乙醇溶液（1 g/L）。称取0.1 g 甲基红溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。

（5）溴甲酚绿乙醇溶液（1 g/L）。称取0.1 g 溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。

（6）混合指示液。1 份甲基红乙醇溶液与3 份溴甲酚绿乙醇溶液现配现用。

（7）吸收液。溶液（1） 和（6）混合均匀而成。

1.3 仪器和设备

ME204/02 型分析天平（感量为1 mg），梅特勒- 托利多仪器（上海） 有限公司产品；K12A 型全自动凯氏定氮仪，上海晟声自动化分析仪器有限公司产品；SH230N 型石墨炉消解仪，山东海能科学仪器有限公司产品；DFT-200C 型超高速粉碎机，温岭市林大机械有限公司产品。

1.4 试验步骤

1.4.1 制样

将经60 ℃烘干的核桃去壳，核桃含油量大，打碎混匀呈泥状，采取减量法称质量。

1.4.2 消解

核桃消解条件：称取核桃样品0.5 g（精确至0.000 1 g）于干燥消解管内，依次加入5 g 硫酸钾，0.5 g 硫酸铜，10 mL 浓硫酸，将消解炉设置为一阶段220 ℃20 min，二阶段440 ℃75 min（消解炉可提前预热至220 ℃），放入样品，打开尾气回收，待时间结束，可观察样品，与试剂空白一样呈澄清，有淡绿色即为消解完全，静置冷却。

1.4.3 蒸馏

检查并补充蒸馏水桶、碱液桶、硼酸桶、标液瓶内试剂；打开电源开关，同时打开自来水阀；在“维护”栏“初始化滴定器”1 次，“清洗滴定缸”3次；开机时，手动先排空酸、碱管气体（点击“维护”再点击“酸泵”“碱泵”），并置换标液（点击“初始化滴定器”3 次），点击“清洗滴定缸”3 次；点击“参数设置”输入“标液浓度”“换算系数”数值；安装一空消化管，关闭安全门，点击“测试”，点击“工作模式”选择“空白测试”，设置碱液量10 mL，吸收液量30 mL，点击“运行”空蒸，当连续2 次空白值相差不大于0.1 mL，取后1 次空白值为仪器空白（消解样空白此时可测），然后把空白值输入“维护”中“参数设置”输入“空白”数据；测定前应先用(NH4)2SO4标准品做氮回收率的测定，借以验证所用仪器、试剂及操作等条件的可靠性；要求(NH4)2SO4标准品氮回收率为95%～105%；点击“测试”依次输入“样品量”“吸收液量”（30 mL） “碱液量（60 mL）”，然后安装样品，点击“运行”。工作完成后，点击“数据”寻找对应的样品编号，点击编号调出测试结果，并记录；全部测试结束，点击“维护”“清洗滴定缸”，关闭电源、水源。

2 结果与分析

核桃样品中蛋白质的含量按以下公式计算：

式中：X——试样中蛋白质的含量，g/100 g；

V1——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

C——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；

0.014 0——盐酸[C(HCl)=1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，g；

m——试样的质量，g；

V3——吸取消化液的体积，mL；

F——氮换算为蛋白质的系数，核桃中氮转换系数为5.30；

100——换算系数。

核桃样品中的蛋白质含量见表1。

表1 核桃样品中的蛋白质含量

3 结论

（1） 核桃含蛋白与脂肪偏高，一阶段消解产生碳化会在消解管内鼓泡，但只要不超过整体消解管1/3 高度；在二阶段时，会有硫酸回流将管壁上的样品冲回，若炭化情况剧烈，可考虑适当降低一阶段温度、延长时间使反应缓和。

（2） 采用K12A 全自动凯氏定氮仪测定核桃中蛋白质的含量平均为15.826 6%，相对标准偏差为0.302 0% （n=6），该方法具有准确、快速、简便、低耗和稳定的优点，是核桃中蛋白质含量测定的首选方法。